黃春國，馬素嫻

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西太谷030801）

在影響植物花色的各種因素中，花色素具有非常重要的作用。近年來，世界各國的學(xué)者對花色素作為影響花色的主要可調(diào)控因素這一研究課題投入了極大的關(guān)注。而花色素主要由3 種不同的花色苷構(gòu)成，分別為甜菜紅色素（Betalains）、類胡蘿卜素（Carotenoids） 和花青素（Anthocyanins）[1]。因此，進(jìn)一步研究花色素形成機(jī)理顯得越來越重要，尤其是對花色素生物合成途徑中各種有關(guān)酶的研究更是具有很重要的意義[2-4]。

二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）屬于NADPH依賴性短鏈還原酶家族，具有專門的NADPH 結(jié)合域，在花色素苷生物合成過程中起著非常關(guān)鍵的作用。其最早發(fā)現(xiàn)于紫羅蘭的一個突變體中，它在花色的修飾中起著很重要的作用，是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶。在花色素苷生物合成代謝途徑中，其主要作用就是將3 種二氫黃酮醇化合物（DHQ，DHK，DHM）還原成無色的花色素苷（Leucoanthocyanidin），并作為下一步驟中花色素苷合成酶（ANS）和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）催化的底物，再進(jìn)一步催化形成穩(wěn)定的花色素苷，從而使植株花器官呈現(xiàn)出各種顏色[4-6]。

煙草（Nicotiana tabacum）為茄科（Solanaceae）煙草屬（Nicotianacco）1 a 生草本植物，在我國南北均有種植，是我國一種重要的經(jīng)濟(jì)作物[7-8]，也是我國國民經(jīng)濟(jì)收入的一個重要支撐。本研究采用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將從野生型煙草中分離和克隆得到的NtDfr1，NtDfr2 基因，通過根癌農(nóng)桿菌方法轉(zhuǎn)入到栽培品種煙草中，得到陽性抗性植株后，收獲種子并進(jìn)行播種，最后對得到的轉(zhuǎn)基因煙草植株中二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）進(jìn)行分析研究，為探索花色素合成途徑提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 植物材料

試驗所用野生型煙草品種為N. tobacco（SNN），N. sylvestins（N. s）和N. tomentosifornis（N.t），獲得的轉(zhuǎn)基因煙草品種分別為：dfr1-2，dfr1-5，dfr1-11 和dfr2-1，dfr2-2，dfr2-3。品種均由美國肯塔基大學(xué)煙草研究中心植物與土壤科學(xué)系重點(diǎn)實(shí)驗室提供。

1.2 宿主菌

試驗使用的大腸桿菌（Escherichia coli）TB1由美國肯塔基大學(xué)煙草研究中心植物與土壤科學(xué)系重點(diǎn)實(shí)驗室提供。

1.3 質(zhì)粒載體

試驗所使用的質(zhì)粒載體為：PGEM-T easy vector，PCAMBIA-2300 vector，PKYLX80 vector 和PCAMBIA-2301 vector。

1.4 PCR 引物

（1）35 S 啟動子引物序列（500 bp）P1：CTT AC GCAGC AGGTC TCATC A；P2 CCACC TTCCT TTTCC ACTAT CTT。（2）煙草DFR 基因引物序列（full-length cDNA） F: 5′-GGC AGA TCT ATG GCA AGT GAA GCT CAT GCA-3′；R: 5′-ATG TCT AGA CTA GAT TTC CCC ATT GGT TGA-3′。（3）煙草DFR1 基因引物序列F：5′-AAC CAA CAG TCA GGG GAA TG-3′；R：5′-TTG GAC ATC GAC AGTTCC AG-3′。（4）煙草DFR2 基因引物序列F：5′-AAC CAA CAG TCA GGG GAA TG-3′；R：5′-TTG GGC ATC GAG AGT TCC AG-3′。（5）KAN 引物序列F：5′-ATG GGG ATT GAA CAA GAT GGA-3′；R：5′-TCA GAA GAA CTC GTC AAG AAG-3′。（6）GAPDH 引物序列F：5′-GGT GTC CAC AGA CTT CGT GG-3′；R：5′-GAC TCC TCA CAG CAG CAC CA-3′。

1.5 試驗方法

采用SDS 法提取樣本的總DNA 和總RNA[9]。利用Primer 3 軟件設(shè)計引物，由Invitrogen 公司合成寡核苷酸片段。使用引物時可將公司合成的引物離心2 min 后，用10 mmol/L Tris-HCl 稀釋為100 μmol/L 的引物原液，離心混勻。再將引物原液稀釋為2.5 μmol/L 用于PCR 反應(yīng)，離心后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型煙草中DFR 基因的鑒定

提取野生型煙草的基因組DNA 后，用設(shè)計好的引物對目的基因DFR 進(jìn)行PCR 反應(yīng)，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)檢測。從圖1 可以看出，野生型煙草中存在DFR 基因。同時還得知，DFR 基因為1 600 bp。

2.2 不同轉(zhuǎn)基因煙草品種中的DFR 基因表達(dá)分析

提取轉(zhuǎn)基因煙草（dfr1-5，dfr1-11 和dfr2-2）和野生型煙草（SNN）幼嫩葉片組織的總RNA后，反轉(zhuǎn)錄人工合成cDNA，后用DFR，DFR1，DFR2，KAN，GAP 序列引物，進(jìn)行PCR 反應(yīng)，然后使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 可知，DFR 基因在dfr1-5，dfr1-11 和dfr2-2 轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)量基本一致，而在野生型煙草（SNN）中的表達(dá)量很少；DFR1 基因在dfr1-5 和dfr1-11 品種中超表達(dá)，在dfr2-2 品種中表達(dá)量明顯變少，但在野生型煙草（SNN）中幾乎不表達(dá)；DFR2 基因在dfr2-2 品種中超表達(dá)，而在dfr1-5 和dfr1-11 品種中表達(dá)量明顯下降，在野生型煙草（SNN）中微量表達(dá)，且條帶不太清晰。由此可知，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）目的基因轉(zhuǎn)入野生型煙草中，能極大地提高二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量，增加其在植物體內(nèi)的積累量，從而增強(qiáng)它的催化作用，促進(jìn)花色素苷的生物合成。

2.3 不同轉(zhuǎn)基因品種與野生型品種DFR 基因表達(dá)的差異性分析

試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因獲得的煙草花色較深或為紅色，表明二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因得到了過量表達(dá)即超表達(dá)，符合試驗預(yù)期目的。

轉(zhuǎn)目的基因NtDfr1，NtDfr2 煙草中花器官的顏色與對照野生型煙草相比，明顯加深且變?yōu)榧t色，這主要是由于在轉(zhuǎn)基因煙草中二氫黃酮醇-4-還原酶得到了超表達(dá)而使花色素大量積累，但是轉(zhuǎn)目的基因NtDfr1，NtDfr2 煙草之間也存在一些差異性，而無法通過肉眼分辨，因此，選用轉(zhuǎn)目的基因dfr1-5，dfr1-11，dfr2-2，dfr2-3 這4 個轉(zhuǎn)基因煙草植株，使用了DFR1，DFR2 序列引物、煙草GAPDH 序列引物，運(yùn)用實(shí)時定量PCR反應(yīng)（QRT-PCR）的方法，對這4 個轉(zhuǎn)基因煙草植株的花器官中目的基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖3 所示。

由圖3 可知，轉(zhuǎn)目的基因NtDfr1，NtDfr2 煙草中的二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型煙草，在14～22 倍之間，但是它們之間也存在一定的差異性，如在dfr2-2 煙草植株中，DFR 基因的表達(dá)量是對照的22 倍，dfr1-5煙草植株中表達(dá)量次之，dfr2-3 煙草植株中最少；在它的花器官中，二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）表達(dá)量大約是野生型煙草的14 倍左右，這些差異性可能是由目的基因在整合、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程中出現(xiàn)了一些變化而造成的，也可能是由外源基因與內(nèi)源基因之間存在的共抑制性造成的，還可能是由于周圍環(huán)境因素的影響而造成了它們之間的差異性。應(yīng)加強(qiáng)利用外源基因的鑒定和遺傳分析的方法，逐步分析和找出造成這種差異性的具體原因，從而提高轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)化效率和對新物種的利用率。

3 結(jié)論與討論

植物花器官的顏色是決定其觀賞價值的一個重要因素，長期以來，人們主要是通過傳統(tǒng)育種的方式獲得一些新異的花色來滿足花卉市場的需求[6]。但由于傳統(tǒng)育種技術(shù)的局限性，近年來，諸多學(xué)者開始把轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入花卉育種領(lǐng)域，極大地縮短了育種年限，減少了傳統(tǒng)育種技術(shù)中常常出現(xiàn)的各種不良性狀等因素的影響[10]。植物基因工程技術(shù)在改變花色應(yīng)用中，既提高了育種效率，又可定向地修飾觀賞植物的特定性狀而不喪失其原有的其他性狀，因此，植物基因工程技術(shù)在花卉育種研究中得到了快速的發(fā)展[11-12]。

本試驗應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，從野生型煙草中克隆得到二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因，然后再轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行超表達(dá)，從而達(dá)到改變花色的目的。試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草的花色明顯加深或變?yōu)榧t色；通過實(shí)時定量PCR 反應(yīng)（QRT-PCR） 可知，二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因在轉(zhuǎn)基因植物中得到了超表達(dá)，為植物花色素苷合成代謝途徑的下一步反應(yīng)提供了充足的反應(yīng)底物，促進(jìn)了花色素苷的生物合成，使植物的花色發(fā)生了改變。

本試驗中，將NtDfr1，NtDfr2 基因轉(zhuǎn)入煙草中，得到了轉(zhuǎn)基因煙草DFR1 和轉(zhuǎn)基因煙草DFR2 這2 個品種，在對這2 個品種進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)，它們之間也存在一定的差異性，二者中的二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）在體內(nèi)的表達(dá)量略有差異，但是從花器官的色彩和形態(tài)上幾乎沒有什么差別，只有在使用實(shí)時定量PCR 反應(yīng)（QRT-PCR）法進(jìn)行分析時，才能看到一些異同。另外，還觀察到轉(zhuǎn)基因煙草植株中有部分花色變淡或變?yōu)榘咨?，其他性狀也略有所改變，生長發(fā)育也較為遲緩，這可能是由于共抑制的作用，外源二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因的導(dǎo)入抑制或沉默了內(nèi)源二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）基因的順利表達(dá)和積累。

總之，本研究所得出的結(jié)論對實(shí)際生活能產(chǎn)生一定的作用，尤其是運(yùn)用到花卉育種領(lǐng)域和生物制藥工程中，既能打破傳統(tǒng)育種技術(shù)的局限性、為培育各種新奇的花色提供必要的技術(shù)手段，又能提高植物體內(nèi)類黃酮類物質(zhì)的積累量、為生物制藥工程提供大量的原料物質(zhì)來源。

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