楊春壯 馬 英 劉艷翠 徐永良 鄭海興 陸迪 任寶松 李俊俊 牡丹江醫(yī)學(xué)院（牡丹江157011）

老年性癡呆（Alzheimer Disease，AD）多發(fā)生在老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，其病因及發(fā)病機(jī)理尚不清楚，多種治療方法目前正在探索中。NSCs具有自我更新能力，并有向多細(xì)胞（神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞等）分化的潛能［1］。目前NSCs對(duì)AD 的治療具有潛在的治療前景［2－3］。而針刺對(duì)NSCs移植后的影響文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)采用β－AP向海馬CA1區(qū)定向注射制做AD 模型，利用體外分離培養(yǎng)的NSCs移植入AD 大鼠，探討針刺對(duì)NSCs移植后對(duì)AD 大鼠海馬NPY 表達(dá)的影響，改善AD 鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1 材料和方法 1.1 儀器和試劑 KWD－808Ⅱ型電針儀（上海），腦立體定位儀，NPY 免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。DMEM／F12（1∶1）培養(yǎng)基和B27無(wú)血清添加劑、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、β—AP（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 AD 動(dòng)物模型的制備 健康成年雄性Wistar大鼠60只，體重（300±50）g［由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黑）2008004］，隨機(jī)分為5組，正常對(duì)照組（正常組）12 只，其余單側(cè)（左側(cè)）海馬注射β－AP 制作AD 模型。制做癡呆模型后，將剩余48只隨機(jī)分成4組：模型組12只，針刺組12只，NSCs移植組（移植組）12只，移植后針刺組（移植針刺組）12只。大鼠用20%烏拉坦（0.55mL／kg）行腹腔注射，動(dòng)物麻醉后采用平頭顱位固定于腦立體定位儀上，按腦立體定位圖譜（AP＝2.22mm ML＝3.0mm DR＝2.8mm）向海馬注射1μLβ—AP（恒溫培養(yǎng)箱37℃卵育1W，臨用前生理鹽水配制成5μg／μL濃度）。緩慢勻速推注，時(shí)間不少于5min，再留針3min。正常組不注射。

1.3 NSCs的分離和純化 取新生24h以?xún)?nèi)的Wistar大鼠在無(wú)菌條件下分離海馬，經(jīng)胰蛋白酶消化、吹打制成單細(xì)胞懸液，以（4～6）×104／mL的細(xì)胞濃度加入含B27、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）（終濃度均為10 ng／mL）的DMEM／F12無(wú)血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每天鏡下觀察，待原代克隆形成后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。以后每5～7d分離克隆傳代一次，方法同前。

1.4 海馬內(nèi)NSCs移植 將傳至第4代的NSCs球懸液移入10mL的離心管內(nèi)，吹打制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104／μL 備用。動(dòng)物模型建立后，行同側(cè)（左側(cè)）海馬NSCs移植。坐標(biāo)為：AP＝2.22mm ML＝3.0mm DR＝2.8mm，用10μL的微量注射器吸取5μL 細(xì)胞懸液，將注射器固定于腦立體定位儀上，在20min內(nèi)注射完畢，留針5 min。緩慢拔出針頭，縫合皮膚。

1.5 針刺方法 采用30號(hào)1寸毫針，選取大鼠百會(huì)、大椎、人中三個(gè)穴位，直刺0.5寸，接通KWD—808Ⅱ型電針儀，刺激參數(shù)：疏密波，頻率10Hz，電壓1.5V，留針10min，持續(xù)電刺激，每日1次，連續(xù)30d。

1.6 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 針刺后，隔日進(jìn)行跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠放入裝置中，使其適應(yīng)3min，然后通以40V 交流電。大鼠受電擊后，其正常反應(yīng)是跳到安全臺(tái)躲避電擊。記錄通電后大鼠受電擊至跳上跳臺(tái)的時(shí)間，作為反應(yīng)期。

1.7 組織切片 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)測(cè)試完畢后隔日麻醉動(dòng)物，經(jīng)左心室－升主動(dòng)脈罐注200mL生理鹽水和250mL 含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液（PB）。取腦后固定2～4h，依次入含15%蔗糖和30%蔗糖PB液中置4℃冰箱過(guò)夜，沉底備用。用冰凍切片機(jī)將海馬作冠狀連續(xù)切片，片厚5μm。

1.8 免疫組化步驟 ①脫蠟、水化組織切片。②3% H2O2去離子水孵育5～10min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。蒸餾水洗3次。③熱修復(fù)抗原：將切片浸入0.01M 枸椽酸鹽緩沖液（1000mL）蒸餾水中（C6H5Na3O7·2H2O 3g，C6H8O7·H2O 0.4g，PH 為6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔10 min后，反復(fù)2 次。冷卻后0.1M PBS（100mL 蒸餾水中加NaCl 9g，NaHPO4·12H2O 6g，Na2HPO4·2H2O 0.4g，PH7.2～7.4）洗滌2次。④滴加一抗（兔抗大鼠NPY），工作濃度1：50，放入濕盒4℃過(guò)夜。⑤滴加生物素化羊抗兔IgG，37℃30min。0.1MPBS洗2min×3次。⑥D(zhuǎn)AB顯色：使用DAB顯色試劑盒（ED1022）。取1mL蒸餾水，加試劑盒中A、B、C 試劑各1滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5～10min之間。蒸餾水洗滌。⑦蘇木素輕度復(fù)染脫水、透明、封片。顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果 2.1 針刺后各組大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)

表1 針刺后各組大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)的比較（±s單位：s）

表1 針刺后各組大鼠學(xué)習(xí)成績(jī)的比較（±s單位：s）

與模型組比較△P＜0.05 與正常組比較▲P＜0.01

組 別n 反應(yīng)期正常組12 5.25±4.71模型組12 10.68±8.96▲移植組12 6.76±10.65△針刺組12 5.91±6.21△移植針刺組12 5.76±7.52△

2.2 針刺對(duì)各組大鼠海馬NPY 表達(dá)的影響

表2 針刺對(duì)各組大鼠海馬NPY 表達(dá)影響的比較（±s mm2）

表2 針刺對(duì)各組大鼠海馬NPY 表達(dá)影響的比較（±s mm2）

與模型組比較△P＜0.01 與正常組比較▲P＜0.05與移植組比較◇P＜0.05

組 別n NPY 陽(yáng)性細(xì)胞面密度正常組12 0.1084±0.0157模型組12 0.0711±0.0251▲移植組12 0.1263±0.0193△針刺組12 0.1128±0.0317△移植針刺組12 0.1580±0.0294△◇

3 討 論 老年性癡呆（AD）是由多種原因引起的腦退行性疾病，臨床常伴隨有學(xué)習(xí)記憶能力的下降，病理檢查發(fā)現(xiàn)海馬、皮層、杏仁核中NPY 免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元顯著減少，同時(shí)還伴有［3H］NPY 結(jié)合水平顯著下降［4］?，F(xiàn)已知，NPY 是哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的多肽之一，對(duì)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程有著明顯的調(diào)節(jié)作用［5］。NPY 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在大腦皮層、海馬結(jié)構(gòu)、丘腦、下丘腦及腦干等處，尤以海馬結(jié)構(gòu)中濃度最高，而海馬結(jié)構(gòu)是調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位［6］。在海馬結(jié)構(gòu)中，大量的NPY 神經(jīng)元存在于CA1區(qū)的錐體細(xì)胞層、CA2與CA3區(qū)的多形層以及齒狀回的門(mén)區(qū)。已有多項(xiàng)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在伴有學(xué)習(xí)記憶損害的疾病中可見(jiàn)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)NPY 免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量的明顯減少［7］。NSCs治療AD 的目的主要通過(guò)兩種途徑：①內(nèi)源性途徑，即誘導(dǎo)內(nèi)源性NSCs增殖與分化，使受損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行自我修復(fù)；②外源性途徑，即直接替代缺損組織或植入基因工程細(xì)胞，這一類(lèi)細(xì)胞能分泌促進(jìn)干細(xì)胞增殖與存活的因子［8］。NSCS移植治療改善大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力的機(jī)制目前還不完全清楚，可能的機(jī)制有：①移植的NSCs使基底前腦膽堿能神經(jīng)元數(shù)目明顯增加，代替潰變的膽堿能神經(jīng)元，同時(shí)提高了中樞膽堿能系統(tǒng)的活性，改善隔區(qū)、海馬等記憶中樞的功能。②移植的NSCs通過(guò)與宿主細(xì)胞的相互作用使腦內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的合成增加，提高了大腦的興奮狀態(tài)。③移植的細(xì)胞在體內(nèi)分泌一些細(xì)胞因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)神經(jīng)元的存活和神經(jīng)纖維的再生，形成側(cè)支發(fā)芽，提高膽堿能纖維的數(shù)量。④證據(jù)表明，無(wú)論是在發(fā)育、成熟還是在衰老過(guò)程中，突觸都處于不斷的退化和重建的動(dòng)態(tài)過(guò)程之中，NSCs通過(guò)誘導(dǎo)宿主腦突觸的可塑性使退變的組織細(xì)胞產(chǎn)生新的突觸。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，針刺主要通過(guò)以下四個(gè)方面達(dá)到延緩衰老目的：一是提高機(jī)體免疫功能；二是可改善腦的氧代謝和血流量；三是可調(diào)整神經(jīng)生化代謝的紊亂；四是可減少自由基的產(chǎn)生。中醫(yī)文獻(xiàn)中無(wú)“老年性癡呆”的病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)認(rèn)為本病屬中醫(yī)“呆病”、“健忘”、“癲證”等范疇。其病因病機(jī)為肝腎虧虛、氣滯血瘀，以腎氣虛衰、髓?？仗?、腦神失養(yǎng)為其根本。臨床研究表明針灸治療AD 療效顯著。針刺治療AD 的原則是補(bǔ)腎活血、醒神開(kāi)竅。補(bǔ)腎活血以治其本，醒神開(kāi)竅以治其標(biāo)。標(biāo)本同治，盡早緩解癥狀，提高患者生存質(zhì)量。

在上述治療原則的指導(dǎo)下，本實(shí)驗(yàn)選取百會(huì)、大椎、人中三穴。百會(huì)穴為督脈和足太陽(yáng)膀胱經(jīng)的交會(huì)穴，具醒神開(kāi)竅之功，為治療老年性癡呆的主要穴位，經(jīng)臨床證實(shí)對(duì)于本病可能出現(xiàn)的精神、神志異常均有一定的療效。大椎出自《素問(wèn)·氣府》，屬督脈經(jīng)穴位，是手足六陽(yáng)經(jīng)的交會(huì)穴，為“諸陽(yáng)之會(huì)”，可通調(diào)諸經(jīng)，增強(qiáng)各臟腑經(jīng)絡(luò)之功效，促使陰陽(yáng)平衡。人中位于鼻下嘴上，鼻通天氣，嘴通地氣，該穴位于天地之間，正是“諸陽(yáng)之?！钡亩矫}與“諸陰之海”的任脈交會(huì)點(diǎn)，具有調(diào)合陰陽(yáng)之功，能滌蕩蒙蔽、醒腦開(kāi)竅、疏經(jīng)通絡(luò)的作用。取此三穴，可通督調(diào)神、調(diào)合陰陽(yáng)，有暢行血脈、行氣化痰、活血生精、藏精生髓之功。AD 最早最重要的癥狀之一即近期記憶障礙，基于此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證其學(xué)習(xí)記憶功能。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是一次性回避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，操作簡(jiǎn)單，能夠比較客觀地反映動(dòng)物經(jīng)過(guò)一次刺激后記憶的獲得能力。實(shí)驗(yàn)表明針刺能夠減少AD 大鼠的跳臺(tái)反應(yīng)期，改善學(xué)習(xí)記憶。結(jié)合AD 病變中海馬NPY免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元顯著減少，本實(shí)驗(yàn)以免疫組化方法定量測(cè)定了NPY 的表達(dá)。結(jié)果顯示，移植針刺組大鼠海馬NPY 表達(dá)比模型組增加（P＜0.01），同時(shí)與移植組比較有顯著性差異，說(shuō)明針刺結(jié)合干細(xì)胞移植比單純干細(xì)胞移植效果更好。

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