徐 彥，劉 圓，呂露陽，張志鋒

西南民族大學(xué)少數(shù)民族藥物研究所，成都 610041

貝母，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列入中品，具有清熱潤肺、化痰止咳的功效，有“止咳圣藥”之稱，在我國應(yīng)用與研究已有兩千余年的歷史。我國大約有60 種45 變種5 變型［1］，《中國藥典》2010 版記載川貝母包括6 個基源，其中卷葉貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)，為常用川貝母的來源之一。近年來，有關(guān)川貝母質(zhì)量評價研究日益增多，包括分類學(xué)鑒定、化學(xué)成分含量測定以及藥效學(xué)的研究等［2-5］。然而，采用“一測多評”法(Quantitative Analysis of Multicomponents by Single marker，QAMS)，測定川貝母中的貝母乙素和貝母甲素還未見文獻(xiàn)報道。

“一測多評”法是一種用于多成分質(zhì)量控制的研究方法，目前已用于中藥質(zhì)量控制的研究，尤其對中藥缺乏對照品的研究具有重要的意義［6］，該法也被2010 年版《中國藥典》采納。本研究應(yīng)用“一測多評”法對卷葉貝母進(jìn)行多指標(biāo)質(zhì)量控制研究，即以貝母乙素對照品為內(nèi)標(biāo)物，通過建立其與貝母甲素的相對校正因子(Relative correction factor，RCF)進(jìn)行含量計算，以降低檢測成本和時間，驗證方法的實用性，為川貝母中其他生物堿的檢測及其它基源川貝母類藥材的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器、試劑和材料

Agilent 1200 高效液相色譜儀(Agilent，美國)，Waters2695 高效液相色譜儀(Waters，美國)，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD 檢測器、工作站;Alltech-2000 ELSD 蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech，美國);Millipore Milli-Q 超純水機(jī)(Millipore，美國);METTLER AE240 電子分析天平(梅特勒-托利多，德國);W201B 恒溫水浴鍋(上海申順生物科技有限公司)。乙腈、甲醇(色譜純，Merck 公司)，乙醇等其他試劑均為分析純。貝母乙素(Peiminine，批號:110751-200709)、貝母甲素(Peimine，批號:110750-200609)對照品均購自中國藥品生物制品檢定所(純度＞98%)。本研究藥材為卷葉貝母(F.cirrhosa)的鱗莖，采集于四川省康定縣境內(nèi)，經(jīng)西南民族大學(xué)劉圓教授鑒定為卷葉貝母。

2 方法與結(jié)果

本研究首先對HPLC-ELSD 同時測定卷葉貝母中的貝母甲素和貝母乙素和進(jìn)行了方法學(xué)考察，然后對一測多評法的耐用性和適用性進(jìn)行了評價，最后對所收集的樣品進(jìn)行測定并比較外標(biāo)法和一測多評法測定結(jié)果的差異。

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 HPLC-ELSD 系統(tǒng)適應(yīng)性條件

以乙腈(A)– 0.08%三乙胺水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0～13 min，20% A→30% A;13～20 min，30% A;20～55 min，30% A→60% A;55～65 min，60% A;65～70 min，60% A→95% A;流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，ELSD 檢測:溫度88 ℃，N2流速2.2 L/min。

2.1.2 對照品溶液的制備

分別取貝母甲素和貝母乙素對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL 各含0.5 mg 和0.5 mg 的貯備溶液。臨用前稀釋，制成混合對照品溶液(貝母甲素0.15 mg/mL，貝母乙素0.2 mg/mL)。

2.1.3 供試品溶液的制備

稱取5 g 卷葉貝母藥材粉末(過40 目篩)，置圓底燒餅中，先用8 mL 氨水浸潤1 h，然后加入100 mL 氯仿-甲醇(4∶1)混合溶劑，70 ℃水浴上加熱4 h，濾渣用50 mL 混合溶劑洗滌，過濾，合并濾液，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用甲醇溶解，定容至5 mL，搖勻即得母液(生藥量1 g/mL)。在進(jìn)行樣品測定時，取母液2 mL 定容于10 mL，得濃度為0.2 g/mL溶液作為供試液。

2.1.4 線性關(guān)系的考察

分別吸取不同體積的貝母甲素和貝母乙素貯備溶液，甲醇溶解并稀釋制成含貝母乙素和貝母甲素的5 個不同質(zhì)量濃度的系列溶液。按上述色譜條件測定，以對照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得貝母乙素的回歸方程分別為y =1. 7387x + 5. 026 (r =0.9992)，線性范圍0.4～6 μg;貝母甲素的回歸方程分別為y =1.6949x + 4.8321 (r =0.9991)，線性范圍0.3～4.5 μg。

2.1.5 精密度試驗

取同一對照品溶液，按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，根據(jù)貝母甲素和貝母乙素的色譜峰面積，計算其RSD 分別為1.7%和0.1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取同一批次卷葉貝母樣品粉末6 份，精密稱定，按2.3 項下操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，測得貝母甲素和貝母乙素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.03%，0.03%，RSD 分別為1.2%和0.8%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

取同一批次的卷葉貝母樣品粉末精密稱定，按2.3 項下操作，分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣分析，測得貝母乙素、貝母甲素色譜峰面積的RSD 分別為0.7%和0.4%，結(jié)果表明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的卷葉貝母樣品粉末6 份，各約2.5 g，精密稱定，分別按已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%和120% 3 個水平加入貝母甲素和貝母乙素對照品，按2.3 項下操作，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，貝母乙素、貝母甲素的加樣回收率分別為99.8%、97.2%，RSD 分別為1.1%和2.8%。

2.2 “一測多評”耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性評價

2.2.1 色譜柱考察

取“2.1.4”項下制備的混合對照品溶液，進(jìn)樣20 μL，以貝母乙素為內(nèi)標(biāo)，計算貝母乙素對貝母甲素的相對校正因子，考察了Dikma Spursil C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)、Agilent Extend C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent Grace C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)等3 種色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表1。表明不同色譜柱所得到的校正因子基本一致。

2.2.2 校正因子重現(xiàn)性考察

取“2.1.4”項下制備的混合對照品溶液，進(jìn)樣20 μL，以貝母乙素為內(nèi)標(biāo)，計算貝母乙素對貝母甲素的相對校正因子RCF，RCF = fs/fi= (As/Cs)/(Ai/Ci)，其中As為內(nèi)標(biāo)s 峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)s 濃度，Ai為某待測成分對照品i 峰面積，Ci為某待測成分對照品i 濃度。本研究考察了Waters 2695 和Agilent 1200 兩種高效液相色譜儀對相對校正因子的影響，結(jié)果見表1，表明在不同的液相色譜系統(tǒng)下所得到的相對校正因子基本一致。

2.2.3 待測色譜峰的定位

采用貝母甲素與貝母乙素內(nèi)標(biāo)的相對保留值(Relative retention time，RRT)作為色譜峰定位標(biāo)準(zhǔn)，RRT=Ts/Ti，Ts為內(nèi)標(biāo)s 保留時間，Ti為某待測成分i 保留時間。并考察了其在不同儀器和不同色譜柱上的重復(fù)性，結(jié)果表明相對保留值波動較小，RSD 2.8%，因而本研究選用相對保留值作為目標(biāo)色譜峰的定位指標(biāo)。并且在此色譜條件下各批貝母樣品的色譜峰峰形較好，分離度高，因此在“一測多評”法的實際應(yīng)用中，可參考藥材典型色譜圖，利用相對保留值定位，根據(jù)內(nèi)標(biāo)貝母乙素的保留時間，通過相對保留值，因而能夠正確判斷目標(biāo)峰的準(zhǔn)確峰位置。

2.3 樣品測定

取4 批卷葉貝母樣品粉末約0.2 g，精密稱定，按2.1.3 項下制備供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣測定。分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算卷葉貝母中貝母甲素和貝母乙素的含量，結(jié)果見表2，圖1。結(jié)果兩種方法所得含量無顯著性差異，由此說明“一測多評”法可用于卷葉貝母的多種生物堿類成分質(zhì)量研究。

表1 貝母甲素的相對校正因子和保留值(n = 6)Table 1 Related correction factors and related retention time of Peimine (n = 6)

表2 外標(biāo)法和QAMS 測定卷葉貝母中貝母甲素和貝母乙素的含量(n=3)Table 2 The results of Peiminine and Peimine in F.cirrhosa by external standard method and QAMS

圖1 混合對照品(A)和川貝母樣品(B)的HPLC-ELSDFig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed markers (A)and F.cirrhosa sample (B)

3 討論

“一測多評”法是指在一定的線性范圍，某一類化學(xué)成分的量(質(zhì)量或濃度)與檢測器響應(yīng)成正比。在多指標(biāo)(s，a，b，…，i，…)質(zhì)量評價時，以藥材(或成藥)中某一典型有效成分作內(nèi)標(biāo)(s)，建立內(nèi)標(biāo)與其它待測成分(a，b，…，i，…)間的相對校正因子(RCF)進(jìn)行計算的質(zhì)量評價模式，該方法實現(xiàn)多成分質(zhì)量控制，同時又能克服中藥對照品較少，不易獲得和檢測成本高等困難，是傳統(tǒng)指紋圖譜對藥材進(jìn)行質(zhì)量評價基礎(chǔ)上的又一個里程碑。

川貝母，由于大多來自野生資源，其價格日益高漲，在市場上魚目混珠的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，因此，對川貝母的資源進(jìn)行質(zhì)量評價，一直是眾多科研工作者致力于解決的問題。本研究以實地采集的川貝母中的卷葉貝母作為研究對象，意在正本清源，為其他基源的川貝母的含量測定提供一種可行的思路。

本研究選用了對不同的流動相以及流動相的比例進(jìn)行了分析，考察了乙腈(A)-0.02%磷酸鹽水溶液(B)為流動相、甲醇(A)-0. 02% 磷酸鹽水溶液(B)等，最終乙腈(A)-0.08%三乙胺水溶液(B)為流動相，分離度高，峰形好?？疾炝瞬煌放频纳V柱以及色譜系統(tǒng)對貝母甲素的相對校正因子的影響，結(jié)果實驗得到的校正因子具有較高的可信度，系統(tǒng)差異較小，通過計算結(jié)果表明，采用一測多評法計算的貝母甲素的結(jié)果和外標(biāo)法測得的結(jié)果沒有顯著性差異。表明一測多評法可以在對照品缺失的情況下，實現(xiàn)定量測定的要求，為貝母類藥材的質(zhì)量評價以及《中國藥典》的修訂提供依據(jù)。

1 Xie ZM(謝志民)，Wang MC (王敏春)，Lv RX (呂潤霞).Herbological study for the beimu categorical chinese medicine on the original plants.Zhong yao cai (中藥材)，2000，23:423-427.

2 Zhou JL，Li P，Li HJ，et al.Development and validation of a liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry method for relative and absolute quantification of steroidal alkaloids in Fritillaria species. J Chromatogr A，2008，1177:126-137.

3 Li HJ，Jiang Y，Li P. Characterizing distribution of steroidal alkaloids in Fritillaria spp.and related compound formulas by liquid chromatography-mass spectrometry combined with hierarchial cluster analysis.J Chromatogr A，2009，1216:2142-2149.

4 Zhou JL，Xin GZ，Shi ZQ，et al.Characterization and identification of steroidal alkaloids in Fritillaria species using liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Chromatogr A，2010，1217:7109-7122.

5 Xu J，Guo P，Liu C，et al.Neuroprotective kaurane diterpenes from Fritillaria ebeiensi.Biosci Biotechnol Biochem，2011，75:1386-1388.

6 Yin M(尹萌)，Meng YL(孟月蘭)，Wen LM(聞琍敏).Quantitative analysis of multi-components with single marker for determination of alkaloids in Phellodendri Amurensis Cortex.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2011，42:1093-1096.