連國琦，周笑犁，孔祥峰 ，馮澤猛，印遇龍

1中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙410125;2南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌330047;3 中國科學(xué)院環(huán)江喀斯特農(nóng)業(yè)生態(tài)試驗站，環(huán)江547100;4 中國科學(xué)院研究生院，北京100039

自20 世紀50 年代報道在飼料中添加抗生素具有促生長效果以來，抗生素便被作為促生長劑而被廣泛用于飼料添加劑?？股氐拈L期使用在促進動物生長和提高畜產(chǎn)品產(chǎn)量的同時，也帶來了嚴重的負面效應(yīng)，如抗生素在畜產(chǎn)品中的殘留，濫用抗生素引起的內(nèi)源感染、二重感染及耐藥菌株的產(chǎn)生，這都會造成畜禽免疫功能的低下和畜產(chǎn)品品質(zhì)的下降［1］。近年來，我國也不斷發(fā)布有關(guān)抗生素和藥物飼料添加劑方面的規(guī)章制度，逐步減少抗生素等藥物的使用量和使用品種。殼聚糖是甲殼素的重要衍生物，是甲殼素脫乙酰度達到70%以上的產(chǎn)物，是除蛋白質(zhì)以外含氮量最大的有機氮源，也是自然界中唯一的堿性多糖。但由于殼聚糖不溶于水，其開發(fā)應(yīng)用受到很大限制［2］。殼寡糖(COS)學(xué)名β-1，4-寡糖-葡萄糖胺，是將殼聚糖經(jīng)特殊的生物酶技術(shù)處理而得到的一種全新產(chǎn)品，作為一種純天然、無污染的物質(zhì)，其資源豐富、生物活性高、無毒副作用，可被機體快速吸收，實際應(yīng)用中問題較少，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，前景廣闊［3］。本試驗測定了COS 對斷奶環(huán)江香豬營養(yǎng)物質(zhì)代謝和腸道微生物的影響，旨在為開發(fā)綠色環(huán)保型飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、飼養(yǎng)管理及分組

飼養(yǎng)試驗于2009 年6 月在廣西環(huán)江東興鎮(zhèn)某香豬養(yǎng)殖場進行。選用21 日齡斷奶的環(huán)江香豬12頭，隨機分成2 組，每組6 頭。按中國地方豬營養(yǎng)需要量［4］并結(jié)合NRC(1998)營養(yǎng)需要量［5］配制基礎(chǔ)日糧。對照組在基礎(chǔ)日糧中添加抗生素，試驗組在基礎(chǔ)日糧中添加0.5%的COS。日糧中加入2 倍水后，調(diào)成粥狀飼喂。日喂3 次，自由采食和飲水。預(yù)試期按常規(guī)免疫程序?qū)υ囏i進行驅(qū)蟲、防疫。正試期為14 d，期間每日觀察豬群的健康情況。

1.2 血漿生化參數(shù)測定

試驗結(jié)束后，每頭試豬前腔靜脈采血10 mL，肝素抗凝，3000 rpm 離心10 min 分離血漿，用CX4 型全自動生化分析儀(Beckman 公司產(chǎn)品)測定血漿總蛋白、白蛋白、尿素氮、血氨、免疫球蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、甘油三酯和膽固醇的含量及堿性磷酸酶的活性。測定方法按照試劑盒(由北京利德曼公司提供)說明進行。

1.3 食糜采集與微生物DNA 提取

處死仔豬后，無菌收集回腸和盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后，-80 ℃保存。在提取DNA 前，樣品于4 ℃解凍，取約3 g 濕重的糞樣，移入50 mL 置于冰預(yù)冷的0.1%吐溫-80 中，充分渦旋，均質(zhì)化后，200 g 低速離心6 min 取上清，將上清12000 g 高速離心20 min棄上清，留沉淀。反復(fù)洗滌沉淀3 次至上清變澄清［6］。將提取的細菌分裝至1.5 mL 離心管中-70℃保存。按TIANGEN 公司細菌基因組DNA 提取試劑盒的說明書提取腸道細菌基因組總DNA，采用NanoDrop? ND1000(NanoDrop Technologies Inc.，DE，USA)測定DNA 的濃度，并以O(shè)D260/OD280 評價DNA 的純度。

1.4 腸道微生物的熒光定量PCR 分析

采用SYBR Green I 染料法，在熒光定量PCR 儀(ABI 7900HT)上進行擴增，并運用Applied Biosystem SDS2.3 進行定量PCR 數(shù)據(jù)分析。以最小Ct 值和最高熒光值為標準，分別對循環(huán)條件、退火溫度、引物濃度進行優(yōu)化。最后確定反應(yīng)體系為20 μL:包括10 μL Takara SYBR Premix Ex Taq(2 ×，預(yù)混MgCl2、dNTP、SYBR Green I 染料、EX-Taq 聚合酶、buffer)，0.4 μL 引物(10 μM)，2 μL cDNA 模板，ddH2O 補充至20 μL。分別設(shè)計5 對引物(具體序列及產(chǎn)物見表1)，用于進行樣品中雙歧桿菌(Bifidobacterium)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、鏈球菌(Peptostreptococcus)、大腸桿菌(Escherichia)和總細菌基于16S rDNA 基因的相對定量。PCR 反應(yīng)程序為:95 ℃，3 min;95 ℃30 s、60 ℃60 s、72 ℃30 s，40 個循環(huán)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。樣品DNA 的檢測采用3 個重復(fù)，取平均值。采用2-△△CT法［7］統(tǒng)計目的基因的相對表達量。

表1 實時定量PCR 相關(guān)引物Table 1 The primers of bacteria determined in real-time PCR

Lactobacillus Reverse - 5’-GAGCCTCAGCGTCAGTTG-3’大腸埃希菌 Forward- 5’-CATGCCGCGTGTATGAAGAA-3’ 95 Escherichia Reverse - 5’-CGGGTAACGTCAATGAGCAAA-3’鏈球菌 Forward - 5’-GATGGACCTGCGTTGTATTAGCT-3’ 277 Peptostreptococcus Reverse - 5’-CCCTTTCTGGTAAGATACCGTCAC-3’總細菌 Forward - 5’-CAGGATTAGATACCCTGGTAGT-3’ 146 Total bacteria Reverse - 5’-CCCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3’

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 初步處理后，采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件ANOVA 程序單因素方差分析對不同處理間數(shù)據(jù)進行顯著性分析，以P ＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 COS 對環(huán)江香豬血漿生化參數(shù)的影響

由表2 可見，與對照組相比，COS 組堿性磷酸酶活性顯著升高(P ＜0.05)，高密度脂蛋白、總蛋白和IgG 濃度均有增加趨勢(P ＞0.05)，低密度脂蛋白、血氨、甘油三酯、膽固醇和尿素氮濃度均有下降趨勢(P ＞0.05)。

表2 日糧添加殼寡糖對環(huán)江香豬血漿生化參數(shù)的影響(n=6)Table 2 Effect of dietary supplementing COS on plasma biochemical parameters in Huanjiang mini-piglets (n=6)

2.2 COS 對環(huán)江香豬腸道微生物的影響

使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取其總DNA 后，測定OD260 和OD280 的吸光值，所提取總DNA 的OD260/OD280 比值均在1.8～2.1 之間，說明提取的DNA 無蛋白、RNA 和有機試劑的污染;對其進行PCR 擴增，結(jié)果表明，所有樣品的擴增效率均較好，擴增片段長度均約為1500 bp(如圖1 所示)。

圖1 DNA-PCR 產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳代表性樣圖Fig.1 Representative PCR profile of bacterial genomic DNA

通過溶解曲線檢測所用引物的特異性，發(fā)現(xiàn)每個樣品的溶解曲線均相似，并沒有額外的峰存在，說明可以排除非特異性擴增的影響。如圖2 所示，雙歧桿菌、乳酸桿菌、鏈球菌、大腸桿菌和總細菌16S rDNA 基因的擴增曲線均為單一的峰型，確認所用引物的特異性較高。

由表3 可見，與對照組相比，COS 組回腸乳酸桿菌數(shù)量顯著增加、鏈球菌數(shù)量顯著降低(P ＜0.05)，盲腸內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌數(shù)量顯著增加、大腸桿菌和鏈球菌數(shù)量顯著降低(P ＜0.05)。

圖2 部分腸道細菌16S rDNA 基因的溶解曲線Fig.2 Dissociation curve of 16S rDNA fragments amplified from part of intestinal bacteria

表3 殼寡糖對環(huán)江香豬部分腸道細菌數(shù)量的影響(n=6)Table 3 Effects of dietary supplementing COS on part of intestinal bacteria in Huanjiang mini-piglets (n=6)

3 討論

中國的小型品種豬資源豐富，如環(huán)江香豬、巴馬香豬等。小型豬作為一種非嚙齒類動物，其解剖學(xué)、生理學(xué)及營養(yǎng)代謝特性與人類極為相似，正逐步成為研究人類疾病的實驗動物模型［8］。香豬是我國乃至世界稀有的特小型豬種，具有獨特的種用價值，現(xiàn)已被農(nóng)業(yè)部列為國家畜禽出口管理二級保護品種［9］。鑒于環(huán)江香豬的飼養(yǎng)管理仍較為粗放，導(dǎo)致日糧中營養(yǎng)成份不夠全面，豬的生長發(fā)育較緩慢，若要大力發(fā)展香豬生產(chǎn)，首先要解決其飼料營養(yǎng)及安全問題。

關(guān)于COS 對動物生產(chǎn)性能的影響，國內(nèi)外已進行了不少研究，但結(jié)果不盡一致［10，11］。在本試驗中，添加COS 14 d 后，斷奶仔豬的生長性能沒有改善，可能與寡糖添加時間短有關(guān)，估計添加較長時間可能會有較好的飼料轉(zhuǎn)化率。

血清中的堿性磷酸酶與脂肪、糖類和蛋白質(zhì)的吸收、運輸、合成等過程密切相關(guān)［12］。血液尿素氮是蛋白質(zhì)代謝的終產(chǎn)物，其濃度受飼料中蛋白質(zhì)含量與品質(zhì)的影響［13］。該濃度主要反映氨基酸在動物體內(nèi)的代謝情況，過量的氨基酸在體內(nèi)進行脫氨基作用會增加血液尿素氮的濃度［14］;氨基酸平衡狀況良好時，血液尿素氮濃度下降。本試驗中，COS 組仔豬堿性磷酸酶活性顯著升高、血漿尿素氮濃度降低，說明仔豬對日糧蛋白質(zhì)的利用能力增強?？偟鞍诐舛鹊纳撸脖砻髯胸i對日糧蛋白質(zhì)的消化吸收作用加強，有助于組織蛋白質(zhì)的合成。由上可見，COS 可提高斷奶仔豬對日糧蛋白質(zhì)的利用，有助于組織蛋白質(zhì)的合成。周笑犁等也報道，在日糧中添加大豆寡糖可降低斷奶環(huán)江香豬血氨和尿素氮水平，改善蛋白質(zhì)代謝，還能提高機體中一些必需氨基酸的含量［15］。

動物腸道菌可分為有益菌與有害菌，二者存在生理性動態(tài)平衡。在微生態(tài)平衡狀態(tài)下，動物腸道中的正常菌群對腸道的結(jié)構(gòu)、功能和健康具有重要作用［16］。健康個體中雙歧桿菌、乳酸桿菌等是正常優(yōu)勢菌群，細菌數(shù)可達1 ×1010～1 ×1011個/g;大腸桿菌和某些鏈球菌屬于腐敗性細菌，細菌數(shù)可達1×105～1 ×107個/g［17］。本試驗結(jié)果表明，COS 對大腸桿菌、鏈球菌等腸道有害菌有明顯的抑制作用，而對雙歧桿菌和乳酸桿菌有明顯的促進作用，這可能與不同腸道菌對低聚糖的利用情況不同有關(guān)。雙歧桿菌能夠很好地利用大多數(shù)功能性低聚糖，而腐敗梭菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌等有害菌則幾乎不能利用各種低聚糖［18］。也有資料表明，殼寡糖由于相對分子質(zhì)量小，易于透過細菌胞膜進入細胞質(zhì)和細胞核內(nèi)，使其細胞內(nèi)部起生物活性的相關(guān)酶發(fā)生泄露，同時與帶負電荷的物質(zhì)如DNA 相互作用，干擾DNA 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其抗微生物活性［19］。乳酸菌和雙歧桿菌在腸道內(nèi)能形成正常菌群并產(chǎn)生短鏈脂肪酸，使腸道酸度增加，從而抑制腸道內(nèi)不耐酸病原菌的繁殖，在動物腸道內(nèi)還可產(chǎn)生細菌素、類細菌素、過氧化氫和某些有機酸等，并可黏附于腸道細胞上，產(chǎn)生占位性競爭和營養(yǎng)性競爭作用［20，21］。

綜上所述，在日糧中添加COS 可以在一定程度上改善機體蛋白質(zhì)代謝，并調(diào)控腸道微生態(tài)平衡，從而促進腸道健康。

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