張曉雷，周明眉 ，趙愛華，茍小軍，吳建兵，惲祥惠，邢麗娜

1上海中醫(yī)藥大學(xué);2 海綠谷制藥有限公司，上海201203;3 上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海200240

黃連、黃芩配伍使用出自《傷寒論》，《醫(yī)宗金鑒》名曰二黃湯。在中藥復(fù)方中出現(xiàn)頻率較高，如瀉心湯、黃連解毒湯、葛根芩連湯、普濟(jì)消毒飲等;2010版藥典中，黃芩黃連在20 多個復(fù)方中配伍使用。

中藥的配伍不等于簡單的藥物加和，不同的中藥配伍具有不同的藥效，其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)也會有所不同。有關(guān)黃連黃芩藥對配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少，其中李偉等［1］用毛細(xì)管電泳及液相色譜法研究黃連黃芩配伍過程化學(xué)成分的變化，發(fā)現(xiàn)黃連黃芩共煎產(chǎn)生沉淀，使有效成分的含量降低;齊粱［2］等應(yīng)用聚酰胺柱層析、薄層層析和飛行時間質(zhì)譜對黃連黃芩藥對煎煮液的沉淀物進(jìn)行了分析，沉淀物主要成分為藥材中的有效成分黃連堿、小檗堿、表小檗堿、巴馬亭、藥根堿及黃芩甙、漢黃芩甙等。盡管如此，但其研究內(nèi)容和方法有所不同。UPLC 是近年來新興的一種色譜技術(shù)，它采用小顆粒填料色譜柱(粒徑小于2 μm)和超高壓系統(tǒng)(壓力大于105kPa)的新型液相色譜技術(shù)，能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時大大縮短分析周期［3］，因此特別適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究。本文利用UPLC-PDA-MS 技術(shù)對黃連、黃芩、黃連黃芩藥對，以及含黃連黃芩的中成藥中的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立全面反映黃連-黃芩藥對化學(xué)成分的分析方法，并進(jìn)行定性及定量分析，最大限度的獲取相應(yīng)的化學(xué)信息，從而為闡明黃連黃芩的配伍機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 實驗藥品及藥材

鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、漢芩黃苷、黃芩素、漢黃芩素及千層紙素A 購自上海融禾生物有限公司(純度＞99%);黃連飲片(批號080201)產(chǎn)地四川，購于上海同濟(jì)堂;黃芩飲片(批號080123)產(chǎn)地河北，購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰尽Ｖ谐伤帲廴S片(SHT)、一清顆粒(YQG)、牛黃上清丸(NHSQP)、蛤蚧定喘膠囊(GJDCC)及葛根芩連片(GGQLT)］購自上海養(yǎng)生堂。

1.2 實驗儀器

Waters 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(ACQUITY/ZQ2000，美國WATERS 公司)，配有Quity 二極管陣列檢測器(PDA)、電噴霧離子化源(ESI)、Masslynx 4. 1 工作站等;BP211D 型1/10 萬電子天平(Satorius Co.，Ltd，德國)等。

1.3 實驗試劑

甲醇(Fisher，美國)、甲酸(Tedia Company，美國)均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm ×2.1 mm，1.7 μm);流動相:0.05%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，梯度洗脫(0～2 min，88%→75% A;2～4 min，75%→69% A;4～6 min，69%→68% A;6～10 min，68%→35% A;10～11 min，35%→35%A;11～12 min，35%→88% A;12～14 min，88%→88% A);流速:0.35 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:3 μL;紫外檢測波長:280 nm。

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI 源);檢測方式:正離子模式(［M +H］+);掃描方式:一級全掃描;噴霧電壓:3.0 KV;錐孔電壓:50 V;霧化氣流量:500 L/h;脫溶劑溫度:350 ℃;離子源溫度:120 ℃。

2.2 對照品溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取對照品鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素及千層紙素A 各約1000 μg，于10 mL 容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度線，得各對照品儲備液。取各對照品儲備液適量，分別稀釋，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得各對照品溶液。

2.2.2 混合對照品溶液的配制

分別精密稱取鹽酸藥根堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、黃芩苷、漢芩黃苷、黃芩素、漢黃芩素及千層紙素A 各約1000 μg 于同一10 mL 的容量瓶中，加適量甲醇超聲溶解并稀釋至刻度線，得混合對照品儲備液(各成分濃度分別為136、99、93、92、117、110、106、115 μg/mL)。取混合對照品儲備液適量，稀釋，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得混合對照品溶液。

2.3 供試溶液的制備

2.3.1 提取物的制備

黃連、黃芩藥材分別粉碎至過20 目篩，干燥后分別稱取黃連50 g、黃芩50 g、黃連-黃芩藥對(1∶1)100 g，按1∶10(g∶mL)加水，浸泡30 min 后煎煮60 min，趁熱濾過，藥渣加8 倍量水再提取60 min，合并兩次提取液，靜置至室溫，3000 rpm 離心10 min，收集各上清液及黃連黃芩藥對(1∶1)沉淀，上清液70℃減壓濃縮，濃縮至稠膏;各稠膏及沉淀80 ℃真空干燥至恒重，稱重(平行三份，黃連平均提取率22.60%，黃芩平均提取率51.83%，黃連黃芩藥對平均提取率13. 38%，黃連黃芩藥對平均沉淀率27.52%)，備用。

2.3.2 供試溶液的制備

2.3.2.1 藥材供試溶液的制備

分別稱取干燥藥材粉末:黃連50 mg、黃芩50 mg、黃連-黃芩藥對(1∶1)50 mg，于10 mL 帶塞玻璃離心管中，加65% 甲醇8 mL 稱重;室溫超聲60 min，稱重并用65%甲醇補(bǔ)足減失重量，3000 rpm 離心10 min，精密吸取上清液，適當(dāng)稀釋后0.22 μm微孔濾膜過濾，即得各供試樣品溶液。

2.3.2.2 提取物供試溶液的制備

分別稱取干燥提取物粉末:黃連25 mg、黃芩25 mg、黃連-黃芩藥對(1∶1)25 mg 及藥對沉淀10 mg于10 mL 帶塞玻璃離心管中，其余操作步驟同上2.3.2.1。

2.3.2.3 含黃連黃芩藥對的中成藥供試溶液的制備

分別稱取干燥中成藥粉末:SHT 50 mg、YQG 50 mg、NHSQP 50 mg、GJDCC 50 mg 及GGQLT 50 mg 于10 mL 帶塞玻璃離心管中，其余操作步驟同上2.3.2.1。

2.4 方法專屬性考察及色譜峰的定性分析

2.4.1 色譜峰來源歸屬及專屬性考察

分別取上述配制的各對照品溶液、混合對照品溶液及供試樣品溶液，UPLC 自動進(jìn)樣3 μL，使用優(yōu)化的梯度洗脫條件洗脫，確定各對照品、混合對照品及供試樣品中各成分的保留時間。色譜圖見圖1(I～X)，由圖1 可知，黃連黃芩藥對提取液中共檢測到十二個主要的色譜峰。其中第1、2、3、4 和5 號峰均來自黃連，第6、7、8、9、10、11 和12 號峰均來自黃芩。這12 個主要的色譜峰保留時間各不相同，其他各峰互不干擾，證明該方法可行，專屬性較高，選擇性好。

圖1 超高效液相色譜圖Fig.1 Typical UPLC chromatograms of the mixed

2.4.2 色譜峰的定性分析

通過比較供試樣品和對照品的色譜峰保留時間(tR)，PDA 采集的色譜峰光譜和正離子方式檢測所得質(zhì)譜信息，確定峰3、4、5、6、9、10、11 和12 分別為藥根堿、小檗堿、巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A。峰2 的紫外光譜與峰4(小檗堿)相似(見圖2-II)，質(zhì)譜圖顯示也極其相似(見圖2-I)，且分子離子均為m/z 336，根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［1，4］，推斷為表小檗堿。峰1 的質(zhì)譜顯示分子離子為m/z 320(見圖2-I)，并根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)［1，4］，推斷為黃連堿。色譜峰1、2、3、4 及5 的質(zhì)譜信息，與文獻(xiàn)［4］報道相符。

圖2 部分黃連成分(1、2、3)的質(zhì)譜圖(I);部分黃連成分(2、3)的紫外吸收圖(II)(3 小檗堿)Fig.2 Typical MS spectra of components 1，2，3 in Coptis (I);Representative UV spectra of components 2，3 in Coptis (II)(3.berberine)

2.5 線性關(guān)系的考察

精密量取上述配制的混合對照品儲備液適量，分別稀釋為10、30、100、300、1000、2000 倍等不同濃度的混合對照品系列溶液，過濾進(jìn)樣，PDA 檢測，以8 種對照品的質(zhì)量濃度(x，μg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，得回歸方程，見表1。

表1 各成分的線性回歸方程及LOD 測定結(jié)果Table 1 Linear regression equation and LOD data of the 8 identified compounds

2.6 精密度試驗

取“2.5”項下所配制的稀釋100 倍的混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，PDA 檢測，計算各峰峰面積的RSD 值，結(jié)果分別為:鹽酸藥根堿0.10%、鹽酸小檗堿2.02%、鹽酸巴馬汀2.12%、黃芩苷0.45%、漢黃芩苷0.15%、黃芩素2.35%、漢黃芩素1.15%和千層紙素A 0.52%。說明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取上述所配制的藥對提取物供試樣品溶液，分別在制備后的第0、3、6、12、16、24 小時進(jìn)樣，PDA 檢測，計算各成分峰面積的RSD 值，結(jié)果分別為:藥根堿3.26%、小檗堿4.32%、巴馬汀4.63%、黃芩苷3.80%、漢黃芩苷4.92%、黃芩素4.61%、漢黃芩素4.47%和千層紙素A 3.78%。結(jié)果表明，8 個成分至少在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

平行制備6 份藥對提取物供試樣品溶液，進(jìn)樣，PDA 檢測，計算各成分峰面積的RSD 值，按所研究各成分的峰面積來考察重復(fù)性;結(jié)果RSD 值分別為:藥根堿3.59%、小檗堿2.01%、巴馬汀4.9%、黃芩苷1.13%、漢黃芩苷4.88%、黃芩素3.89%、漢黃芩素2.95%及千層紙素A 4.62%。結(jié)果表明:該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗

精密稱取9 份黃連-黃芩藥對(1∶1)干燥藥材粉末，分別于10 mL 帶塞玻璃離心管中;每份10 mg，每3 份為1 組，各組分別加入混合對照品儲備液(各成分濃度分別為136、99、93、92、117、110、106、115 μg/mL)1、0.5、0.1 mL 做為高、中、低加樣組，然后再分別加65%甲醇至8 mL，稱重后按供試樣品溶液制備及測定方法進(jìn)行操作，根據(jù)實際測得含量和已知含量的差值計算回收率。結(jié)果各成分高、中、低加樣回收率的平均值分別為:藥根堿101. 52%、101.88%、103. 33%;小檗堿99. 29%、103. 91%、100.97%;巴馬汀103. 76%、105. 47%、106. 77%;黃芩 苷102. 33%、94. 29%、99. 96%;漢 黃 芩 苷101.32%、99. 69%、96. 27%;黃 芩 素103. 75%、104.19%、105.27%;漢黃芩素104.53%、97.90%、99. 75%;千 層 紙 素 A 104. 18%、109. 09%、109.17%。各成分高、中、低加樣回收率的RSD 均小于5.0%。結(jié)果表明:該方法準(zhǔn)確、可行。

2.10 樣品測定

取上述所配制的各供試樣品溶液，進(jìn)樣，PDA檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各成分含量。按藥根堿、小檗堿、巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素及千層紙素A 的含量來研究藥對黃連、黃芩配伍的相互作用;此外，利用所建立的方法成功地對含該藥對的部分中成藥進(jìn)行了質(zhì)量考察，其結(jié)果見表2。實驗發(fā)現(xiàn)，黃連配伍黃芩后，產(chǎn)生大量黃色絮狀沉淀，使黃連黃芩提取物重量降低26%;對藥對提取物及沉淀進(jìn)行分析與測定，發(fā)現(xiàn)提取物中含藥根堿0. 75%、小檗堿0. 45%、巴馬汀2. 03%、黃芩苷8.56%、漢黃芩苷3.89%、黃芩素0.51%，而沉淀中含藥根堿1.08%、小檗堿17.45%、巴馬汀1.12%、黃芩苷37.31%、漢黃芩苷4.04%、黃芩素0.81%，均高于提取物，其中小檗堿、黃芩苷最多。

表2 樣品測定結(jié)果(平均結(jié)果，mg/g，n = 3)Table 2 Quantification results of samples (All data expressed as mean，mg/g，n = 3)

3 小結(jié)與討論

本實驗在同一條件下，對黃連、黃芩及黃連黃芩藥中的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立全面反映黃連、黃芩及黃連黃芩藥對所含化學(xué)成分的分析方法，效果較好，方法簡單、方便、可行，并與有關(guān)文獻(xiàn)［1，5］相比，也大大的縮短了分析時間;應(yīng)用該方法對黃連、黃芩及黃連黃芩藥對進(jìn)行定性及定量分析，最大限度的獲取相應(yīng)的化學(xué)信息，從而為闡明黃連黃芩的配伍機(jī)制奠定基礎(chǔ);并且還成功地對部分含該藥對的中成藥進(jìn)行了含量測定。本實驗可以定性并能定量的成分較多，雖然只測定其中8 種成分，但可為中藥及中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供了一個較為合理的思路;目前，中藥及中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定，往往以其中的一種或兩種成分為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制，但中藥的療效往往是多種中藥或多種成分的協(xié)同作用，所以以其中的一兩種成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)缺乏科學(xué)性，若盡可能多的檢測相關(guān)成分，則可顯著提高中藥或中藥制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其安全有效可控提供可靠保障。

實驗中發(fā)現(xiàn)藥對混煎時，提取物重量降低近30%，同時也發(fā)現(xiàn)沉淀中主要含有與煎液成分相同的化學(xué)成分，即藥根堿、小檗堿、巴馬汀、黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、及漢黃芩素等，與有關(guān)文獻(xiàn)［1，2］一致。沉淀中小檗堿、黃芩苷分別多達(dá)17. 45%、37.31%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于提取物中的相應(yīng)含量0. 45%、8.56%。此外大量研究證實，產(chǎn)生沉淀的原因是由于黃連中的原小檗堿型生物堿為堿性化合物，與黃芩中的多酚類化合物黃芩苷等酸性化合物相互結(jié)合，生成分子量較大的水不溶物而產(chǎn)生沉淀，同時藥理實驗也證明沉淀物具有藥效作用［2］。根據(jù)中醫(yī)理論，黃連黃芩藥對屬清熱燥濕配伍的經(jīng)典藥對，二者皆屬苦寒之品，均能清熱燥濕、瀉火解毒，常相須合用起協(xié)同作用，以發(fā)揮最佳療效;由于中藥方劑傳統(tǒng)入藥方式為湯劑，其配伍共煎后產(chǎn)生的沉淀大部分以混濁液的形式一起服用，而沉淀一般是兩類成分形成的復(fù)合物，進(jìn)入人體內(nèi)，受環(huán)境影響不斷解離，起到緩釋的作用，對臨床療效的影響不大，而對于相關(guān)的成藥或有關(guān)研究，由于制備工藝中的過濾步驟除去了大部分沉淀，勢必對其療效造成較大影響;在中醫(yī)處方中常見對特殊藥味的“先煎”、“后下”、“另燉”等醫(yī)囑，其實都是前人通過實踐摸索出各藥味的性質(zhì)后，為避免其有效成分的損失或增加煎出量而采取的相應(yīng)措施。因此，在明確了含酸堿成分對藥的方劑煎煮會導(dǎo)致酸、堿性有效成分煎出量減少這樣的事實，就應(yīng)該采用分煎方式，盡量避免有效成分的損失，以保證有效成分最大限度的保留;傳統(tǒng)的湯劑人藥也可以考慮“另煎”(即分煎)的方式，以提高療效，降低費(fèi)用。

本實驗采用藥材和水1∶10 的提取溶劑比例，目的考察其習(xí)慣提取方法的提取效率及藥對配伍在提取過程中的相互影響，此外根據(jù)黃連、黃芩有效成分的溶解性(黃芩苷溶解度甲醇1569 μg/mL、乙醇1458 μg/mL、水60 μg/mL［6］)及有關(guān)文獻(xiàn)［7］，分別進(jìn)行溶媒甲醇及65%甲醇水提取預(yù)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用65%甲醇提取各有效成分效果較好，故采用65%甲醇提取并進(jìn)行相應(yīng)的定性定量分析，結(jié)果取得滿意效果。

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