陳塏鈿 宗凌 周蔚 劉敏 姜鴻彥

遺傳因素在先天性聾病因中占重要位置。目前發(fā)現(xiàn)的致聾基因超過(guò)60 個(gè)，常見的有：GJB2、SLC26A4、線粒體DNA、GJB3、GJB6 等，以GJB2基因最常見［1～3］，GJB3和GJB6基因突變?cè)谶z傳性聾患者中已見報(bào)道［4～6］。GJB3可表現(xiàn)為雙等位基因座突變，或與GJB2基因表現(xiàn)為雙基因復(fù)合雜合突變［6］。GJB3和GJB6的總體突變率較低［7～9］。

目前我國(guó)廣東、湖南和廣西三省的非綜合征型聾患者的GJB3和GJB6基因突變資料尚缺，因此，本研究對(duì)來(lái)自這三省的200例非綜合征型聾患者進(jìn)行GJB3和GJB6基因突變篩查，分析這兩個(gè)基因的人群突變率，為今后這些地區(qū)的耳聾人群基因篩查提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集來(lái)自廣東、廣西和湖南非綜合征型聾散發(fā)病例200例，男118例，女82例，其中廣東144例，湖南28例，廣西28例，均為先天性聾或后天遲發(fā)性雙耳聾。病例就診時(shí)年齡11 月～47歲，平均7.75±6.56歲。耳聾分級(jí)參照WHO 1997年日內(nèi)瓦推薦的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)聽力較好耳0.5、1、2、4 kHz的純音平均聽閾［10］分為：正常：＜25dB HL；輕度聽力損失：26～40dB HL；中度：41～60dB HL；重度：61～80dB HL；極重度：≥81dB HL；本組患者中輕度6例，中度12例，重度33例，極重度149例。每位患者均進(jìn)行詳細(xì)的病史采集和系統(tǒng)的體格檢查，排除可能的致聾病因（高膽紅素血癥、腦膜炎、腮腺炎后遺癥等）及綜合征型聾。聽力學(xué)檢查包括純音聽閾、聲導(dǎo)抗和耳聲發(fā)射，嬰幼兒或配合欠佳患者行聽性腦干反應(yīng)（ABR）及聽性穩(wěn)態(tài)反應(yīng)（auditory steady state responses，ASSR）檢查?；颊呋蚱浼覍俸炇鹬橥鈺?，采集患者外周血4 ml，采用常規(guī)氯仿抽提法提取DNA，－80 ℃保存。應(yīng)用1%瓊脂糖進(jìn)行電泳和分光光度計(jì)進(jìn)行DNA 純度和濃度鑒定。中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并同意此項(xiàng)研究。

1.2 引物設(shè)計(jì) GJB3引物序列為F：TACGATGGTTTTTCCTCTAATTCT，R：TTGCATAACTTAGTGAACTCAGAG，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度985 bp。GJB6引物序列為F：TATCACCGTGTCACTTTCC，R：CAGGTTGGTATTGCCTTC，PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度937bp。參照文獻(xiàn)［11］，合成檢測(cè)del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）突變的引物，引物由上海生工公司合成。

1.3 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)采用25μl反應(yīng)體系，2×PCR Buffer mixture 12.5μl，DNA 50ng，引物各5pmol，加ddH2O 至25μl。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5分鐘，94 ℃變性30秒，56 ℃退火30秒，72 ℃延伸30秒，35 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后再72 ℃延伸7分鐘，4 ℃保存。取2μl進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）采用Touch－Down PCR，反應(yīng)條件詳見文獻(xiàn)［11］。取6μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，直接判斷野生型或大片段缺失突變。

1.4 PCR 產(chǎn)物測(cè)序 PCR 產(chǎn)物純化后，以PCR 引物作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，利用ABI公司3730測(cè)序儀進(jìn)行Sanger測(cè)序反應(yīng)。

1.5 序列比對(duì) 應(yīng)用chromas軟件分析測(cè)序結(jié)果，測(cè)序結(jié)果與GJB3 （NM＿001005752.1）和GJB6（NM＿001110219.2）基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果

200例非綜合征型聾患者中，發(fā)現(xiàn)GJB3 580G＞A（A194T）雜合突變2 例，其中1 例為GJB2 109G＞A（V37I）和GJB3 580G＞A （A194T）復(fù)合雜合突變（圖1），另外1例GJB2和GJB6基因均未發(fā)現(xiàn)突變；250G＞A （V84I）雜合突變1例（也未發(fā)現(xiàn)GJB2和GJB6突變），474G＞A（M158I）雜合突變1例（表1）。前兩種突變位點(diǎn)均已見報(bào)道［7，8］，突變位于connexin 31 蛋白高度保守區(qū)，可能為病理性突變。474G＞A 雜合突變導(dǎo)致第158位蛋氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，突變的性質(zhì)暫不明確。此外，這200例患者中，發(fā)現(xiàn)357C＞T 雜合突變35例，357C＞T純合突變1例，由于正常人群中也存在357C＞T 純合突變，該突變可能為多態(tài)性突變。據(jù)此推算，廣東、湖南和廣西三省非綜合征型聾人群中，GJB3等位基因突變頻率約為1% （4／400）。

圖1 GJB3和GJB2雙基因復(fù)合雜合突變

表1 200例非綜合征型聾患者GJB3基因篩查結(jié)果

200例患者中均未發(fā)現(xiàn)GJB6基因突變。對(duì)del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）的特異性PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果均為330bp的條帶，未發(fā)現(xiàn)GJB6 大片段缺失突變。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，本組非綜合征型聾患者GJB3等位基因突變頻率約為1%，突變位點(diǎn)以580G＞A為主（2例，0.5%），均未發(fā)現(xiàn)GJB6突變，說(shuō)明GJB6在這些人群中突變率極低，在臨床篩查中可暫不列為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

Liu等［6］報(bào)道，GJB3 基因580G＞A 突變形式表現(xiàn)為GJB3 580G＞A＋GJB2 235delC 或GJB3 580G＞A＋GJB2 299－300delAT 復(fù)合雜合突變，這個(gè)突變位于connexin 31蛋白高度保守區(qū)，在200例正常人群中也未發(fā)現(xiàn)，但在先證者的正常聽力的親代發(fā)現(xiàn)雜合突變。因此，這個(gè)突變可能為致病性突變，突變形式為隱性遺傳。本組也有一例病例表現(xiàn)為GJB3 和GJB2 復(fù)合雜合突變，其中，GJB2 109G＞A 的致病性仍存在很大的爭(zhēng)議［12，13］，GJB2 109G＞A 被認(rèn)為是病理性突變［12，13］，或增加環(huán)境易感性的突變。本組GJB2和GJB3復(fù)合突變的病例，推測(cè)為遺傳因素引起的耳聾，其致病機(jī)制暫不明確。

GJB3 250G＞A 突變由李慶忠等［7］首先報(bào)道，他們?cè)?50名正常對(duì)照組中未發(fā)現(xiàn)同樣突變，各物種多種連接蛋白氨基酸序列進(jìn)化分析證實(shí)該突變位點(diǎn)位于connexin31高度保守的第二跨膜區(qū)。關(guān)于GJB3 580G＞A 和250G＞A 的致病機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。此外，本組病例中發(fā)現(xiàn)1例患者攜帶GJB3 474G＞A 雜合突變，該突變引起第158 位蛋氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，突變的性質(zhì)暫不明確，正常人群中尚未發(fā)現(xiàn)攜帶此突變。該突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸非位于高度保守區(qū)，推測(cè)該突變致病可能性低。

GJB6突變報(bào)道見于Marlin 等［5，11］報(bào)道，多見于歐美人群［11，14］。與GJB2 不同，GJB6 基因突變?cè)趪?guó)人耳聾患者中并不常見［8，9］。本研究廣東、廣西和湖南200例非綜合征型聾患者中未發(fā)現(xiàn)GJB6突變，推測(cè)GJB6在國(guó)人非綜合征型聾患者中并非主要致病基因。GJB6突變中，兩種大片段缺失突變del（GJB6－D13S1830）及del（GJB6－D13S1854）比較多見［11，14］，其致病機(jī)制可能為通過(guò)反式效應(yīng)（in cis effect）作用于上游的GJB2 基因，抑制GJB2基因mRNA 的表達(dá)而致聾［15，16］。本研究參照del Castillo等［11］方法，對(duì)200 例非綜合征型聾患者進(jìn)行這兩種突變的檢測(cè)，均未發(fā)現(xiàn)突變，與韓東一等［8，9］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明在國(guó)內(nèi)耳聾人群中，GJB6基因突變可暫不列入臨床常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。

本研究也存在一定的不足：首先，病例樣本數(shù)量仍較少，今后需要進(jìn)一步增加樣本數(shù)，并合理分配病例的地域來(lái)源，以更好地驗(yàn)證本研究結(jié)果。其次，對(duì)GJB3可能的病理性突變位點(diǎn)，如GJB3 580G＞A和250G＞A 的致病機(jī)制，尚需進(jìn)行深入的研究。

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