王艷艷 姜艷霞,* 沙德禮 羅德禮 孫世剛

(1廈門大學化學化工學院化學系,固體表面物理化學國家重點實驗室,福建廈門361005; 2香港城市大學物理與材料科學系,香港)

電化學和紫外-可見吸收光譜法研究pH和金納米粒子對細胞色素c的影響

王艷艷1姜艷霞1,*沙德禮2羅德禮2孫世剛1

(1廈門大學化學化工學院化學系,固體表面物理化學國家重點實驗室,福建廈門361005;2香港城市大學物理與材料科學系,香港)

制備了粒徑均勻、平均粒子尺度為(4.7±0.6)nm,表面修飾3-巰基丙酸(MPA)的金納米粒子(Au NPs).利用電化學和紫外-可見(UV-Vis)吸收光譜研究了pH和Au NPs對細胞色素c(Cyt c)結(jié)構(gòu)的影響.UV-Vis吸收光譜結(jié)果表明,pH為7.5-3.0時,Cyt c和Cyt c-Au NPs復合物的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯變化.當pH=2.0時,Cyt c和Cyt c-Au NPs復合物的Soret譜峰位置均發(fā)生明顯移動,說明pH誘導其構(gòu)象發(fā)生變化.循環(huán)伏安(CV)結(jié)果表明,表面修飾了MPA的Au NPs能促進Cyt c和電極之間的電子傳輸,與修飾了檸檬酸根的Au NPs相比,其生物兼容性更好.pH的變化會引起CV中Cyt c峰電流的改變和峰電位的移動.隨著pH值的降低,Cyt c電活性的量逐漸減小,并且pH誘導Cyt c發(fā)生不可逆變性.Au NPs的引入使自由態(tài)的Cyt c耐酸性增強,而使得吸附態(tài)的Cyt c耐酸能力減弱.

金納米粒子;細胞色素c;pH值;循環(huán)伏安法;紫外-可見吸收光譜

1 引言

金納米粒子(Au NPs)具有易于制備、導電性高、生物兼容性好等優(yōu)點而被廣泛應用于生物醫(yī)學領(lǐng)域,如DNA檢測、1,2酶的固定、3,4信號放大5,6等.但也有研究表明,生物分子和Au NPs長時間接觸會導致生物分子構(gòu)象變化、部分解折疊、甚至變性.7-9一個有效的改進方法是進行Au NPs的表面修飾,如在Au NPs表面修飾一些有效的“阻擋層”,避免Au NPs和生物分子直接接觸,從而減小生物分子變性的可能性.10-12

pH值對生物分子的結(jié)構(gòu)有很大影響,研究不同pH值下生物分子的物理化學性質(zhì)將幫助人們認識生物分子隨著pH值變化的規(guī)律,從而對生物分子的應用提供一定的參考.細胞色素c(Cyt c)在線粒體呼吸鏈中起著非常重要的作用,對它的研究備受關(guān)注.13-16最近研究表明,pH誘導Cyt c變性后,Cyt c表現(xiàn)出過氧化物酶的性質(zhì),即Cyt c的活性隨著pH值的減小而降低,但對過氧化氫的氧化活性增加.17普遍認為Au NPs的生物兼容性好而被廣泛引入到Cyt c體系,然而Au NPs對吸附態(tài)Cyt c隨pH變化產(chǎn)生怎樣的影響,這是一個值得關(guān)注的問題.

本文采用UV-Vis吸收光譜法研究了溶液中的Cyt c以及Cyt c-Au NPs復合物隨著pH值的變化規(guī)律.以共價鍵合的方法將Cyt c固定在了混合自組裝層上,采用循環(huán)伏安(CV)法檢測了引入3-疏基丙酸(MPA)修飾的Au NPs前后Cyt c活性隨pH值的變化規(guī)律,同時分析了Au NPs在Cyt c電子轉(zhuǎn)移中所起的作用.

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

11-巰基十一烷酸(MUA,95%),11-巰基十一烷醇(MU,97%),3-巰基丙酸(99%),馬心Cyt c(純度＞95%,Mw=12384)購自于美國Sigma公司.1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)購自于美國Thermo Scientific公司.將50 mmol·L-1的KH2PO4和50 mmol·L-1的K2HPO4溶液混合制備不同pH值的磷酸鹽緩沖溶液(PBS),pH值分別為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5.Cyt c儲備液的濃度為5 mg·mL-1,溶解在pH=7.0的PBS溶液中,4°C下保存.Au NPs采用相轉(zhuǎn)移法18在香港城市大學制備.其它試劑均為分析純,實驗用水均為超純水.

電化學工作站采用上海辰華CHI-660A.三電極體系,工作電極為柱狀金電極(Φ=5 mm),輔助電極為鉑電極,參比電極為飽和甘汞電極(SCE).UV-Vis吸收光譜用日本島津公司Carry-5000 UV-Vis吸收光譜儀測量,以超純水作為參比溶液.透射電鏡(TEM)照片由日本JEM2100儀器得到.pH計為美國單佛UB-7系列.

2.2 實驗過程

電極的制備:金電極分別采用1、0.3和0.05 μm的氧化鋁研磨粉研磨,超純水超聲清洗,再在0.1 mol·L-1H2SO4溶液中于-0.20 V到1.45 V電位區(qū)間循環(huán)掃描,直至獲得Au電極的標準特征峰,表明已獲得潔凈的Au電極.然后依次用大量的超純水和無水乙醇清洗電極.將電極放置于20 mmol·L-1的MU和MUA的乙醇溶液(n(MU):n(MUA)=3:1)中室溫自組裝24 h,得到組裝有MU和MUA的混合單層(Au-SAMs).用無水乙醇和PBS(pH=7.0)清洗電極除去電極表面吸附的過量的MU和MUA.將Au-SAMs電極浸入5 mg·mL-1的Cyt c溶液中4°C下保存1 h,此時Cyt c靜電吸附在電極表面.接著將電極浸泡在5 mmol·L-1的EDC溶液中30 min,共價固定Cyt c,得到Au-SAMs-Cyt c電極.Au NPs的吸附是將Au-SAMs-Cyt c電極浸泡于納米金的PBS溶液中,浸泡時間為30 min,得到Au-SAMs-Cyt c-Au NPs.由于EDC的作用,Cyt c共價固定在自組裝分子層上,19所以該種固定方法能使Cyt c牢固地固定在電極表面;當pH從12.0變化到4.0的過程中,11-巰基烷酸自組裝層從金電極表面脫附的電壓范圍是-1.0到-0.9 V,20因此該自組裝膜在電化學研究條件下仍然是穩(wěn)定的.

UV-Vis吸收光譜樣品的制備:加入5 mg·mL-1, 150 μL的Cyt c分別于3 mL,pH為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5的PBS溶液中得到Cyt c在不同pH值下的樣品.Cyt c-Au NPs復合物的制備是將50 μL約0.05 mg·mL-1的Au NPs加入到1 mL的5 mg· mL-1Cyt c儲備液中.加入上述Cyt c-Au NPs復合物各150 μL于3 mL,pH值為2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5的PBS溶液中即得到不同pH值的Cyt c-Au NPs樣品.

3 結(jié)果與討論

3.1 Au NPs的TEM和UV-Vis吸收光譜表征

圖1A是表面修飾MPA的Au NPs的TEM圖,從圖中可以看出,Au NPs粒徑均勻,大多數(shù)為球形.粒徑統(tǒng)計結(jié)果(圖1B)顯示,Au NPs平均粒徑為(4.7± 0.6)nm(用于粒徑統(tǒng)計的Au NPs數(shù)目為255個).圖1C是表面修飾MPA的Au NPs的UV-Vis吸收光譜,從圖中可以看出,Au NPs的吸收峰約為517 nm.

3.2 中性pH下Au NPs對Cyt c電子傳輸?shù)挠绊?/h3>

圖2是組裝到金電極上的Cyt c吸附Au NPs前后的CV曲線.對比發(fā)現(xiàn),吸附了Au NPs之后的Cyt c仍然表現(xiàn)出明顯的氧化還原反應特征:吸附Au NPs前,Cyt c的氧化還原峰電流分別為-0.6364和0.6971 μA;吸附Au NPs之后,Cyt c的氧化還原峰電流為-0.6353和0.6353 μA.電活性的Cyt c的量利用公式(1)進行計算.

Γ=Q/(nFA) (1)其中,Γ是Cyt c的表面覆蓋度,Q是Cyt c氧化還原峰積分電量的平均值,n是反應電子數(shù),F是法拉第常數(shù),A是電極的實際面積.吸附Au NPs之前,電活性的Cyt c的量是3.03 pmol·cm-2,說明Cyt c是亞單層吸附.19吸附Au NPs之后,電活性的Cyt c的量沒有發(fā)生明顯變化.有研究表明,20Cyt c顯示電活性的量和吸附Au NPs的尺寸(如5和20 nm)以及吸附時間(如40 min和18 h對比)都有關(guān)系.對不同粒徑的Au NPs,吸附的時間越長,顯示電活性的Cyt c的量越少;對于相同的吸附時間,Au NPs的粒徑越大,顯示電活性的Cyt c的量越少.對比文獻結(jié)果,在粒徑尺寸和吸附時間相當?shù)那闆r下,本實驗體系A(chǔ)u NPs的加入使Cyt c的變性量相對較少,主要是由于使用的Au NPs表面修飾有MPA分子,避免Cyt c和Au NPs直接接觸,降低其變性幾率.

圖2 (A)Au-SAMs-Cyt c和(B)Au-SAMs-Cyt c-Au NPs在50 mmol·L-1PBS中的CV曲線Fig.2 CV curves of(A)Au-SAMs-Cyt c and(B)Au-SAMs-Cyt c-Au NPs in 50 mmol·L-1PBSpH=7.0,scan rate:100 mV·s-1;PBS:phosphate buffered solution

表1為加入Au NPs前后Cyt c氧化還原的峰電位和峰電流.從表1數(shù)據(jù)可以看出,Au NPs加入前, Cyt c對應的氧化還原峰電位分別是-0.002和-0.048 V,Au NPs加入之后,Cyt c對應的氧化還原峰電位分別是-0.002和-0.042 V,從而其對應的氧化還原峰電位之差分別是0.046和0.04 V,說明Au NPs的加入使得Cyt c氧化還原反應的可逆性提高.根據(jù)Laviron理論,21計算出吸附Au NPs前后的電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)分別為2.6和3.9 s-1,說明Au NPs的吸附促進了Cyt c和電極之間的電子轉(zhuǎn)移.

Au NPs常被用于生物體系.22-26當構(gòu)筑成Au-SAMs-Au NPs-Cyt c結(jié)構(gòu)時,Au NPs起到了協(xié)助Cyt c和電極之間的長程電子傳遞的作用;當構(gòu)筑成Au-SAMs-Cyt c-Au NPs結(jié)構(gòu)時,Au NPs增強了Cyt c膜層的導電性.對比Au-SAMs-Cyt c體系,Au-SAMs-Cyt c-Au NPs體系的電子傳輸路徑將發(fā)生變化.電子從電極通過SAMs傳遞到Cyt c之后會在Au NPs之間傳輸,從而使那些因吸附取向而電子傳遞受阻的Cyt c(約占吸附在電極表面Cyt c總量的72%)27將有可能表現(xiàn)出電活性,從理論上講,加入了Au NPs之后,體系電活性的Cyt c的量將增大.但報道結(jié)果20,28表明,Au NPs的引入使得電活性Cyt c的量減小,這說明Au NPs對Cyt c有毒化作用.我們的實驗結(jié)果也表明,和沒有修飾MPA的Au NPs相比, Cyt c失活的程度有所降低,但是電活性Cyt c的量并沒有增加,所以,Au NPs的表面優(yōu)化仍是一個十分重要的問題.

表1 加入Au NPs前后Cyt c氧化還原的峰電位和峰電流Table 1 Peak potentials and peak currents of Cyt c before and after incorporation ofAu NPs

圖1 Au NPs的透射電鏡(TEM)圖(A)、對應的粒徑統(tǒng)計圖(B)及UV-Vis吸收光譜(C)Fig.1 Transmission electron microscopy(TEM)image(A),the corresponding histogram of cross-sectional diameter(B), and UV-Vis absorption spectrum(C)ofAu NPs

3.3 Cyt c和Cyt c-Au NPs的UV-Vis吸收光譜

表征

我們用UV-Vis吸收光譜法研究了溶液中的Cyt c以及Cyt c-Au NPs復合物的Soret和Q吸收譜帶隨著pH的變化關(guān)系.圖3A為氧化型Cyt c在pH= 7.0的PBS中的UV-Vis吸收光譜,408和530 nm的吸收譜峰分別對應于Cyt c的Soret譜帶和Q譜帶.圖3A中的插圖為Cyt c和Cyt c-Au NPs復合物在pH=5.0的PBS中的UV-Vis吸收光譜.由于Au NPs的UV-Vis吸收峰(517 nm)和Cyt c的Q譜帶吸收峰(530 nm)位置接近,兩個峰之間存在交疊.而Au NPs的吸收峰對Cyt c的Soret譜帶(408 nm)沒有影響,因此我們用Soret譜帶吸收峰面積為標準,對 Cyt c和Cyt c-Au NPs復合物的吸收譜帶進行歸一化.從插圖歸一化結(jié)果可以看到,pH=5.0時Cyt c的Q譜帶在530 nm,當加入Au NPs子后,該峰移到527 nm,且峰寬增加,表明Au NPs和Cyt c混合后, 530 nm處歸屬于Cyt c的譜峰受到了Au NPs的干擾,使得譜峰藍移.

圖3B為Cyt c的Soret譜帶和Q譜帶隨pH值的變化關(guān)系曲線.從圖3B可以看出,pH在3.0-7.5范圍內(nèi),Cyt c的Soret吸收譜帶在408 nm;在pH=2.5附近,Cyt c的Soret吸收譜帶位置發(fā)生明顯移動,pH為2.5和2.0的Soret譜帶分別在406和395 nm.在相同的pH變化區(qū)間,Soret吸收譜帶隨著pH值的變化趨勢與文獻29報道結(jié)果一致.Cyt c-Au NPs復合物的Soret吸收譜帶變化趨勢與Cyt c一致.在pH為2.5-7.5范圍內(nèi),Cyt c的Q吸收譜帶在530 nm附近,當pH為2.0時,Q譜帶位置移動到495 nm,較pH=7.0時Cyt c的標準譜峰位置(530 nm)移動了35 nm.對于Cyt c-Au NPs復合體系,在整個pH變化區(qū)間,其譜峰位置均在527-533 nm內(nèi)變化,當pH=2.0時,仍沒有觀察到譜峰位置的明顯變化,表明Au NPs的加入對Cyt c的Q譜帶的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定化作用.

Cyt c的Soret譜帶和Q譜帶來源于卟啉環(huán)和金屬π-π*之間的轉(zhuǎn)變,a2u-b1u和a2u-eg軌道過渡偶極矩之間的累加效應分別影響Soret譜帶和Q譜帶.21因此,Soret譜帶和Q譜帶位置的移動說明pH誘導Cyt c的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化.對于Cyt c-Au NPs復合體系,pH從7.5到2.0變化時,530 nm附近吸收譜峰沒有發(fā)生明顯的位置移動,即Cyt c的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生明顯的變化.從而可以說明,Au NPs的加入使溶液相Cyt c耐酸能力增強.我們推測,這可能是由于Au NPs在Cyt c表面的吸附阻礙了溶劑和Cyt c的直接接觸所致.

圖3 (A)Cyt c在pH=7.0的PBS中的紫外吸收譜;(B)Cyt c(實線)和Cyt c-Au NPs復合物(虛線)的Soret譜帶和Q譜帶的UV-Vis吸收峰隨著pH值的變化關(guān)系Fig.3 (A)UV-Vis absorption spectrum of Cyt c in PBS at pH=7.0;(B)UV-Vis absorption peaks of Soret band and Q band of Cyt c(solid line)and Cyt c-Au NPs complex(dotted line)as a function of pH valueThe insert in figureAshows the UV-Vis absorption spectra of Cyt c and Cyt c-Au NPs complex in PBS at pH=5.0, which is normalized by the spectrum of Soret band.

3.4 pH和Au NPs對吸附態(tài)Cyt c的影響

圖4A和4B分別是Cyt c在不同pH下的CV曲線及對應的還原峰電流,圖4C和4D是Cyt c吸附Au NPs后在不同pH下的CV曲線及對應的還原峰電流,其中的插圖是對應的局部放大圖.Cyt c的氧化還原是指血紅素中心卟啉鐵二價和三價之間的轉(zhuǎn)換.對于Au-SAMs-Cyt c體系(圖4A),當pH從7.5變化到2.0時,氧化還原峰變寬,峰電流變小(圖4B).當pH為3.0時,Cyt c氧化還原峰消失,峰電流幾乎為零.根據(jù)CV結(jié)果,積分電活性Cyt c的量,對應pH值分別為6.0、5.0、4.0、3.0的電活性的Cyt c的比例分別為93.6%、67.4%、37.7%、5.8%.當溶液的pH值從2.0回復到7.5時,仍然觀察不到Cyt c的氧化還原峰,說明pH值誘導Cyt c的變性是不可逆的, Waldeck小組17的報道也支持了這一結(jié)論.

圖4C是吸附了Au NPs后的Cyt c在不同pH下的CV曲線,從圖中可以看出,pH值為7.0時,Cyt c顯示電活性的量最大.隨著pH值的減小,Cyt c的峰電流呈現(xiàn)減小趨勢;pH值為4.0時,氧化還原峰電流幾乎消失(圖4D).對比沒有吸附Au NPs的體系,吸附Au NPs之后的Cyt c完全變性的pH值提前了一個單位.積分不同pH值下電活性Cyt c的量,對應pH值6.0、5.0、4.0的電活性Cyt c的比例分別為90.3%、65.4%、6.0%,相比沒有吸附Au NPs的體系,相同pH值時電活性的Cyt c的比例減小,說明吸附Au NPs之后的Cyt c抵抗pH值保持自身結(jié)構(gòu)的能力降低.同時發(fā)現(xiàn),pH值恢復到中性范圍的時候,變性后的Cyt c在CV掃描的時候不顯示電活性,說明吸附了Au NPs的Cyt c由pH誘導的變性也是不可逆的.

圖4 (A)Au-SAMs-Cyt c體系不同pH下的CV曲線,(B)相應還原峰電流(扣除了雙電層后的凈電流)及對應(A)的局部放大圖,(C)Au-SAMs-Cyt c-Au NPs體系不同pH下的CV曲線,(D)相應還原峰電流(扣除了雙電層后的凈電流)及對應(C)的局部放大圖Fig.4 (A)CV curves ofAu-SAMs-Cyt c for different pH values;(B)the cathodic peak currents(double-layer current is deducted)of CV curves in(A)as a function of pH and the insert is partial enlarged view of(A);(C)CV curves of Au-SAMs-Cyt c-Au NPs for different pH values;(D)the cathodic peak currents(double-layer current is deducted)of CV curves in(C)as a function of pH and the insert is partial enlarged view of(C)

由于該自組裝膜在研究條件下是穩(wěn)定的,因此我們推斷構(gòu)象變化引起失活是Cyt c不顯示電活性的一個主要原因.Cyt c活性中心和電極之間的距離是影響Cyt c電活性的關(guān)鍵因素.文獻32表明,采用以羧酸基為末端的自組裝分子(HS(CH2)xCOOH)將Cyt c固定到電極表面,當x≥8時,標準電子轉(zhuǎn)移速率常數(shù)隨著電活性中心和電極之間距離的增大呈指數(shù)衰減.本工作中采用x=10的自組裝分子,所以當電活性中心和電極之間的距離增大時,其電流將呈指數(shù)衰減.pH降低誘導Cyt c解折疊,肽鏈打開,血紅素暴露出來,血紅素縫隙的打開可以促進Cyt c和電極之間的電子傳輸,但是在循環(huán)伏安中并沒有觀察到電流增大的現(xiàn)象.我們推測,Cyt c在解折疊和穩(wěn)定化過程中,其血紅素中心和電極之間的距離增大,所以,在CV中觀察不到其明顯的氧化還原電流.解折疊的蛋白質(zhì)和自組裝雙分子之間的相互作用可能使Cyt c發(fā)生了不可逆變性.疏水的肽鏈部分可以與自組裝分子層的烷基鏈結(jié)合,33血紅素部分可以與水分子配合.21這些穩(wěn)定化作用將抑制Cyt c恢復到自然狀態(tài).此外通過對比UV-Vis和CV的結(jié)果發(fā)現(xiàn),吸附在電極表面的吸附態(tài)Cyt c的穩(wěn)定性低于其在溶液中的自由態(tài)Cyt c:溶液中的Cyt c在pH=2.5附近發(fā)生結(jié)構(gòu)的明顯變化,吸附態(tài)Cyt c以及吸附了Au NPs的Cyt c在pH分別為3.0和4.0時,幾乎完全失活.我們推測可能與Cyt c結(jié)構(gòu)變化的靈活性有關(guān),當Cyt c吸附在電極表面時,其肽鏈部分和自組裝分子層之間發(fā)生化學鍵合,限制了Cyt c在電極表面的流動,從而其穩(wěn)定性下降.

4 結(jié)論

Cyt c以亞單層共價固定在電極表面.CV結(jié)果顯示,pH為中性時,Au NPs使得Cyt c和電極之間的電子傳輸能力增強;但電活性Cyt c的量沒有明顯變化,表明Au NPs的加入使得Cyt c部分失活.UV-Vis和CV結(jié)果表明,pH能誘導Cyt c變性,Au NPs的加入使得自由態(tài)Cyt c耐酸能力增強,吸附態(tài)Cyt c耐酸能力減弱.變性的主要原因是pH使Cyt c的構(gòu)象發(fā)生了變化,而且這種變性是不可逆的.Au NPs的加入使得吸附態(tài)Cyt c完全變性的pH值提前一個單位.

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(33) Murgida,D.H.;Hildebrandt,P.;Wei,J.;He,Y.F.;Liu,H.; Waldeck,D.H.J.Phys.Chem.B 2004,108,2261.

January 13,2012;Revised:February 29,2012;Published on Web:March 7,2012.

Effect of pH and Au Nanoparticles on Cytochrome c Investigated by Electrochemistry and UV-Vis Absorption Spectroscopy

WANG Yan-Yan1JIANG Yan-Xia1,*SUSHAAndrei2ROGACHAndrey2SUN Shi-Gang1
(1Key Laboratory of Physical Chemistry of Solid Surface,Department of Chemistry,College of Chemistry and Chemistry Engineering,Xiamen University,Xiamen 361005,Fujian Province,P.R.China;2Department of Physics and Materials Science,City University of Hong Kong,Hong Kong,P.R.China)

In this paper,gold nanoparticles(NPs)with an average size of(4.7±0.6)nm,capped with mercaptopropionic acid(MPA)ligand,are prepared.The effect of pH and Au NPs on cytochrome c(Cyt c) is investigated by electrochemistry and UV-Vis absorption spectroscopy.UV-Vis absorption spectra indicate that the structures of Cyt c and Cyt c-Au NPs complex do not change appreciably between pH=7.5 and pH=3.0,but their Soret band positions change markedly at pH=2.0,indicating that low pH value induces a conformational change in Cyt c.Cyclic voltammetry(CV)result shows that Au NPs capped with MPA enhance electron transfer between Cyt c and the electrode.The data also reveals that the biocompatibility of Au NPs is improved when citric acid ligand is replaced with MPA.The change in pH value causes a change of peak currents in CV and a shift of peak potential.When pH value deviates from 7.0,levels of electroactive Cyt c decrease.Significant pH change induces irreversible denaturing of Cyt c. The pH at which Cyt c-Au NPs complex denatures completely is one unit higher than that of Cyt c. Combining the results from UV-Vis spectroscopy and CV,we find that addition of Au NPs makes adsorbing state Cyt c more vulnerable to pH.

Au nanoparticle;Cytochrome c;pH value;Cyclic voltammetry;UV-Vis absorption spectroscopy

10.3866/PKU.WHXB201203073

?Corresponding author.Email:yxjiang@xmu.edu.cn;Tel:+86-592-2180181.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20833005,20873116,60936003,21021002).

國家自然科學基金(20833005,20873116,60936003,21021002)資助項目

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