張 喆 祁志美 張蓉君

(中國科學(xué)院電子學(xué)研究所,傳感技術(shù)國家重點實驗室,北京100190)

基于ITO電極的細(xì)胞色素c吸附層的直接電化學(xué)

張 喆 祁志美*張蓉君

(中國科學(xué)院電子學(xué)研究所,傳感技術(shù)國家重點實驗室,北京100190)

采用未經(jīng)修飾的銦錫氧化物(ITO)工作電極直接探測到了細(xì)胞色素c(Cyt c)吸附層的氧化還原峰,并得出了Cyt c的表面濃度,隨著溶液濃度從2 μmol·L-1增大到10 μmol·L-1,Cyt c的表面濃度相應(yīng)地從0.35×10-12mol·cm-2增大到1.53×10-12mol·cm-2.實驗獲得的表面濃度倒數(shù)與溶液濃度倒數(shù)的準(zhǔn)線性關(guān)系說明Cyt c在ITO表面的吸附基本滿足Langmuir等溫吸附理論.對Cyt c溶液的循環(huán)伏安測試結(jié)果表明參與電極反應(yīng)的Cyt c包括游離分子和吸附分子,前者的貢獻(xiàn)大于后者,電極反應(yīng)主要受擴(kuò)散控制并呈準(zhǔn)可逆過程.根據(jù)Nicholson方法估算得到反應(yīng)物的標(biāo)準(zhǔn)異相速率常數(shù)的平均值為1.65×10-3cm·s-1.實驗結(jié)果顯示在室溫下放置1 h后Cyt c吸附層電化學(xué)活性部分喪失,在80°C下放置1 h后吸附層完全失活.失活的Cyt c吸附層對鐵氰化鉀溶液在Au電極上的電極反應(yīng)具有明顯的阻礙作用.

細(xì)胞色素c吸附層;直接電化學(xué);Langmuir等溫吸附;表面濃度

1 引言

細(xì)胞色素c(Cyt c)是一種典型的氧化還原蛋白質(zhì),它廣泛存在于動植物體內(nèi),并在線粒體的呼吸鏈中起著傳遞電子的重要作用,因此獲得了廣泛研究.1-27Cyt c分子含有一個亞鐵血紅素基團(tuán),具有電化學(xué)活性,常采用電化學(xué)的方法對它進(jìn)行研究.由于Cyt c的電化學(xué)活性中心被肽鏈所包裹,活性中心不能直接接觸電極,電子在電極與活性中心之間的轉(zhuǎn)移是通過特定電子轉(zhuǎn)移鏈進(jìn)行的.研究表明Cyt c分子在金電極表面的吸附非常強(qiáng),會導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活,從而影響了分子內(nèi)部的特定電子轉(zhuǎn)移鏈,使得電子在活性中心與電極間的傳輸受到抑制.7,8因此,利用普通金電極對Cyt c進(jìn)行直接電化學(xué)測量較為困難,通常需要對電極進(jìn)行表面修飾以及在待測溶液中加入促進(jìn)劑,1-26這為Cyt c的電化學(xué)研究帶來了很大的不便.

銦錫氧化物(ITO)玻璃具有導(dǎo)電能力強(qiáng),化學(xué)穩(wěn)定性強(qiáng),不易引起Cyt c變性和無需對電極表面進(jìn)行任何修飾即可對Cyt c進(jìn)行直接電化學(xué)測量的優(yōu)點.22-27ITO玻璃還具有良好的透光性,容許在電化學(xué)測量的同時進(jìn)行光學(xué)測量(如光譜電化學(xué)測量).28在pH=7.2的水溶液中,Cyt c與ITO電極帶有相反的電性,Cyt c分子可以通過靜電作用吸附在ITO電極的表面,這為Cyt c吸附層的直接電化學(xué)測量提供了可能性.已有文獻(xiàn)大多通過對金電極進(jìn)行復(fù)雜的表面修飾后再研究Cyt c溶液的直接電化學(xué),與此相比,采用ITO電極研究Cyt c的直接電化學(xué)要簡單得多.

本文采用未經(jīng)修飾的ITO導(dǎo)電玻璃作為工作電極,鉑片作為對電極,Ag/AgCl作為參比電極,對低濃度下Cyt c吸附層和Cyt c溶液在ITO電極上的直接電化學(xué)進(jìn)行了研究,并根據(jù)測量結(jié)果對反應(yīng)物的動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了計算.實驗分析了Cyt c吸附層分子的活性對電化學(xué)反應(yīng)的影響.此外,還采用裸露的Au工作電極研究了Cyt c吸附層對K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6電極反應(yīng)的影響.

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

馬心Cyt c(純度≥95%)購自美國Sigma公司,使用前未經(jīng)進(jìn)一步提純,鐵氰化鉀(純度≥99.5%)、亞鐵氰化鉀(純度≥99.5%)、磷酸二氫鉀(純度≥99.5%)及十二水合磷酸氫二鈉(純度≥99%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,硝酸鉀(純度≥99%)購自西隴化工股份有限公司,均為分析純,實驗中使用的去離子水經(jīng)過Milli-Q純凈水機(jī)二次凈化.Reference 600型電化學(xué)分析儀購自美國Gamry公司.蠕動泵購自保定蘭格恒流泵有限公司.

2.2 實驗方法

以10 mmol·L-1的磷酸緩沖溶液(PBS,pH=7.2)為底液,配制了濃度分別為2、4、6、8、10 μmol·L-1的馬心Cyt c溶液.以0.2 mol·L-1的硝酸鉀水溶液為底液,配制了鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6]的混合溶液,Fe3+和Fe2+離子的濃度均為1 mmol·L-1.電化學(xué)測試系統(tǒng)由三電極組成:Ag/ AgCl為參比電極,鉑為對電極,ITO(或Au)為工作電極,兩種工作電極的實際反應(yīng)面積均為1 cm2.

3 結(jié)果與討論

3.1 利用ITO電極研究Cyt c吸附層的直接電化學(xué)性能

Cyt c和ITO的等電點分別為10和6,6,29因此在pH 7.2的溶液中Cyt c分子帶正電而未加電壓的ITO電極顯負(fù)電性,使得Cyt c分子可以通過靜電作用吸附在ITO電極表面.實驗時,我們采用蠕動泵注入和抽取溶液樣品,因此在整個實驗過程中無需將電極從反應(yīng)池中取出,從而確保各電極位置不變.在利用ITO電極對其上的Cyt c吸附層進(jìn)行直接電化學(xué)測量前,首先對PBS底液進(jìn)行了循環(huán)伏安掃描,如圖1曲線a所示,在-200-200 mV的掃描區(qū)間內(nèi),沒有觀察到PBS底液的氧化還原峰.之后將反應(yīng)池中的PBS底液用4 μmol·L-1的Cyt c溶液代替并靜置約15 min后再次進(jìn)行循環(huán)伏安測量,結(jié)果如圖1曲線c所示,可以明顯觀察到Cyt c的特征氧化還原峰,氧化峰位于82 mV(vs Ag/AgCl)附近,還原峰位于13 mV(vs Ag/AgCl)附近.為了消除Cyt c溶液對測量結(jié)果的影響,將Cyt c溶液取出并對反應(yīng)池進(jìn)行清洗后再次注入PBS底液對在ITO上形成的Cyt c吸附層進(jìn)行循環(huán)伏安測量,結(jié)果如圖1中曲線b所示,在與曲線c近似相同的電壓區(qū)間出現(xiàn)了一對氧化還原峰,該氧化還原峰完全對應(yīng)于ITO電極表面的Cyt c單分子吸附層的氧化還原過程.曲線c的峰電流比曲線b的大,說明Cyt c溶液的循環(huán)伏安測量結(jié)果既包含表面吸附的蛋白質(zhì)分子的貢獻(xiàn)又有溶液中游離的蛋白質(zhì)分子的貢獻(xiàn).

圖1 利用ITO電極測得的不同條件下的循環(huán)伏安曲線Fig.1 Cyclic voltammograms measured using ITO electrodes under different conditionsPBS:phosphate buffered solution

根據(jù)Laviron模型,吸附層循環(huán)伏安法的峰電流ip可以表示為式(1)的形式:30,31

進(jìn)而推導(dǎo)出電化學(xué)活性物質(zhì)的表面濃度Γ的計算式(2):

其中,Q為測得的Cyt c吸附層的還原峰電量,相應(yīng)于圖1中曲線b的還原峰電量,n為電極反應(yīng)的得失電子數(shù)(對于Cyt c,n=1),A為電極的實際反應(yīng)面積, ν為掃描速率,F為法拉第常數(shù),R為理想氣體常數(shù),T為絕對溫度.當(dāng)Cyt c溶液的濃度為4 μmol·L-1時,對曲線b的還原峰面積積分得到的Q值為92.32×10-9C,此時Γ為0.96×10-12mol·cm-2,略小于文獻(xiàn)3,13,22-24報道的修飾電極的Γ值.由于Cyt c分子在ITO電極表面的非可逆吸附,每完成一組實驗后需要更換一片新的ITO電極再進(jìn)行測量.采用相同方法還測試了溶液濃度為2、6、8、10 μmol·L-1時的Cyt c吸附層的循環(huán)伏安曲線,并對每一條曲線的還原峰面積積分得到不同溶液濃度(C)所對應(yīng)的Cyt c表面濃度Γ.結(jié)果表明當(dāng)溶液濃度從2 μmol·L-1增加到10 μmol·L-1,Γ相應(yīng)地從0.35×10-12mol·cm-2增大到1.53×10-12mol·cm-2,并呈現(xiàn)出飽和趨勢.按照Langmuir等溫吸附模型,表面濃度Γ與溶液濃度滿足如下方程:

其中,Γmax為最大表面濃度,X為常數(shù).由方程(3)可知,表面濃度Γ的倒數(shù)(Γ-1)與溶液濃度C的倒數(shù)(C-1)呈線性關(guān)系(即:ΓmaxΓ-1=1+KC-1).圖2顯示了實驗獲得的Γ-1與C-1的關(guān)系曲線,二者呈準(zhǔn)線性關(guān)系(線性擬合度為0.9514),說明Cyt c分子在ITO表面的吸附近似滿足Langmuir等溫吸附模型.

圖2 在ITO電極上測得的Cyt c表面濃度倒數(shù)與溶液濃度倒數(shù)的準(zhǔn)線性關(guān)系Fig.2 Quasi-linear relationship between the two reciprocals of surface concentration and solution concentration measured with ITO electrodes

我們還利用Cyt c溶液的循環(huán)伏安曲線對Γ值進(jìn)行了計算(電量Q相應(yīng)于圖1中曲線c的還原峰電量),結(jié)果指出隨著Cyt c溶液濃度從2 μmol·L-1增大到10 μmol·L-1,Γ從0.83×10-12mol·cm-2增大到5.01×10-12mol·cm-2.相同溶液濃度下Cyt c溶液所對應(yīng)的Γ值是Cyt c吸附層所對應(yīng)的Γ值的2至3倍,說明在對Cyt c溶液進(jìn)行循環(huán)伏安測試時,溶液中游離的Cyt c分子對電極表面反應(yīng)的貢獻(xiàn)大于電極表面吸附的Cyt c分子的貢獻(xiàn).

3.2 利用ITO電極研究Cyt c溶液的直接電化學(xué)

圖3 利用ITO電極測得的10 μmol·L-1Cyt c溶液的循環(huán)伏安曲線Fig.3 Cyclic voltammograms of the 10 μmol·L-1 Cyt c solution measured with the ITO electrodev(scan rate)/(mV·s-1):(a)10,(b)20,(c)50,(d)100

圖3為利用ITO電極測得的10 μmol·L-1Cyt c溶液的循環(huán)伏安曲線.曲線由內(nèi)至外對應(yīng)的掃描速率分別為10、20、50和100 mV·s-1.由氧化還原峰電位計算得到的Cyt c溶液的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原式電位E0?=(Epa+Epc)/2=(60.80±6.00)mV(vs Ag/AgCl),與Hill等1,2采用修飾的Au電極對Cyt c的測量結(jié)果250 mV(vs NHE)接近.表1給出了不同掃描速率下Cyt c溶液的氧化還原峰電位差ΔEp=Epa-Epc=(90.80± 4.00)mV,大于單電子電極反應(yīng)所對應(yīng)的58 mV,且|ipa|≠|(zhì)ipc|,這說明Cyt c溶液在ITO電極上發(fā)生的是準(zhǔn)可逆的氧化還原反應(yīng).31

表1 25°C時Nernst體系對應(yīng)的ΔEp和ψ的文獻(xiàn)值31,32以及計算得到的k0Table 1 Literature values31,32of ΔEpand ψ in the Nernst system at 25°C and the calculated k0

圖4所示為氧化還原峰電流與電壓掃描速率平方根的關(guān)系曲線.隨著掃描速率的增加,峰電流值隨之增大(圖中電流的正負(fù)號僅代表電流的方向),且呈準(zhǔn)線性關(guān)系,表明溶液中游離的Cyt c分子在ITO電極上的反應(yīng)主要受擴(kuò)散控制.2,6-9,27根據(jù)Nernst方程得出峰電流ip如式(4)所示:31

其中,ip為峰電流(單位:A),n為參與電極反應(yīng)的電子數(shù)(對于Cyt c,n=1),A為電極的實際反應(yīng)面積(單位:cm2),D為反應(yīng)物的擴(kuò)散系數(shù)(單位:cm2·s-1),ν為掃描速率,C為反應(yīng)物的初始濃度.將圖4線性擬合曲線的斜率代入式(4)計算得到溶液中的被氧化的Cyt c分子和被還原Cyt c分子的擴(kuò)散系數(shù)分別為DO=0.61×10-6cm2·s-1和DR=1.39×10-6cm2·s-1,與文獻(xiàn)2,7,10,27報道的值接近.

圖4 氧化峰和還原峰電流與掃描速率平方根的準(zhǔn)線性關(guān)系Fig.4 Quasi-linear dependences of the redox peak currents on the square root of scan rate

根據(jù)Nicholson方法,31,32標(biāo)準(zhǔn)異相速率常數(shù)k0可以通過式(5)計算得到:

其中,ψ為與ΔEp(峰電位差)相關(guān)的循環(huán)伏安法的無量綱速率參數(shù),可通過查詢表1確定,T為絕對溫度(室溫298 K),α為無量綱的電子傳遞系數(shù).對于單步驟單電子反應(yīng)過程,假設(shè)α=0.5,將各參數(shù)代入式(5)計算得到不同掃描速率下的k0值列于表1,與文獻(xiàn)7,10,16-18,27,32報道的值接近.

3.3 Cyt c吸附層活性對電極反應(yīng)的影響

Cyt c活性的好壞直接影響電化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果,為此采用ITO工作電極在4種不同條件下進(jìn)行了循環(huán)伏安測試,電解液均為PBS底液.實驗結(jié)果如圖5所示,其中曲線a對應(yīng)于未修飾的ITO電極,曲線b對應(yīng)于載有Cyt c吸附層的ITO電極(即:Cyt c/ITO電極),曲線c是將Cyt c/ITO電極在25°C下空氣中靜置1 h的測量結(jié)果,曲線d是將Cyt c/ITO電極在80°C下空氣中干燥1 h后的測量結(jié)果.從曲線a可以看出在掃描區(qū)間內(nèi)沒有氧化還原峰出現(xiàn),曲線b可以觀察到在55 mV附近出現(xiàn)一對氧化還原峰,對應(yīng)于在ITO電極表面吸附的Cyt c分子的氧化還原過程,曲線c中的氧化還原峰電流的強(qiáng)度有所下降,表明在25°C下空氣中靜置1 h后,Cyt c吸附層中的部分分子失去了活性,曲線d同樣沒有觀察到氧化還原峰,說明在80°C下干燥1 h后Cyt c吸附層的電化學(xué)活性完全喪失.

圖5 利用ITO電極和PBS電解液測得的不同條件下的循環(huán)伏安曲線Fig.5 Cyclic voltammograms obtained using the ITO electrode and PBS electrolyte under different conditions bare ITO electrode(a),ITO electrode with a Cyt c adlayer(Cyt c/ITO electrode)(b),Cyt c/ITO electrodes kept at 25°C for 1 h(c) and at 80°C for 1 h(d)

圖6 利用Au電極在吸附Cyt c前(a)后(b)測得的K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6混合溶液的循環(huán)伏安曲線Fig.6 Cyclic voltammograms of K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 mixed solution obtained with aAu electrode before(a)and after(b)Cyt c adsorption

采用Au電極對濃度為2-10 μmol·L-1的Cyt c溶液進(jìn)行循環(huán)伏安測量,均未觀測到Cyt c的特征氧化還原峰.已報道的文獻(xiàn)7,8指出,Cyt c與Au電極強(qiáng)烈的吸附作用導(dǎo)致Cyt c分子的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而喪失電化學(xué)活性.為了研究Cyt c吸附層對Au電極特性的影響,實驗中采用K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6的混合溶液作為電解液進(jìn)行了測試.圖6所示為Au電極表面吸附Cyt c前后對K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6混合溶液進(jìn)行循環(huán)伏安法測量的結(jié)果.曲線a是吸附前的測量結(jié)果,從圖中可以看出氧化還原峰電位差較小且氧化還原峰電流較大,表現(xiàn)為可逆的氧化還原反應(yīng).曲線b是吸附后的測量結(jié)果,與曲線a對比發(fā)現(xiàn)峰電位差增大,反應(yīng)的可逆性變差,且峰電流也有較大的降幅,說明失活的Cyt c吸附層對Au電極的電極反應(yīng)具有一定的阻礙作用.

4 結(jié)論

采用未經(jīng)修飾的ITO工作電極對Cyt c吸附層進(jìn)行了原位直接電化學(xué)研究,并基于循環(huán)伏安曲線計算得到了在不同溶液濃度下的Cyt c表面濃度,進(jìn)一步得出Cyt c表面濃度的倒數(shù)與溶液濃度倒數(shù)呈準(zhǔn)線性關(guān)系,說明Cyt c在ITO電極表面的吸附近似遵循Langmuir等溫吸附模型.對Cyt c溶液的直接電化學(xué)研究表明電極反應(yīng)受擴(kuò)散控制,并且表現(xiàn)為準(zhǔn)可逆的氧化還原過程,根據(jù)Nicholson方法估算得到反應(yīng)物的標(biāo)準(zhǔn)異相速率常數(shù)的平均值為1.65× 10-3cm·s-1.Cyt c吸附層的活性可以通過電化學(xué)信號的強(qiáng)弱反映,25°C下在空氣中靜置1 h后,Cyt c吸附層分子部分失活;在80°C下放置1 h后,Cyt c吸附層分子完全失活.實驗還采用Au工作電極研究了Cyt c吸附層對K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6電化學(xué)反應(yīng)的阻礙作用.

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December 2,2011;Revised:February 16,2012;Published on Web:February 24,2012.

Direct Electrochemistry of Cytochrome c Adlayer on the ITO Electrode

ZHANG Zhe QI Zhi-Mei*ZHANG Rong-Jun
(State Key Laboratory of Transducer Technology,Institute of Electronics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

The electrochemical redox reaction of a cytochrome c(Cyt c)adlayer on an indium tin oxide (ITO)electrode was directly monitored and the surface concentrations of Cyt c versus solution concentrations were obtained from cyclic voltammograms.The results indicate that the surface concentration increases from 0.35×10-12to 1.53×10-12mol·cm-2when the solution concentration is increased from 2 to 10 μmol·L-1.A quasi-linear relationship between the reciprocals of surface concentration and solution concentration was observed,indicating that Cyt c adsorption on the ITO electrode closely obeys the Langmuir isothermal adsorption model.The cyclic voltammograms of the Cyt c solutions with the ITO electrode reveal that both adsorbed and dissociated Cyt c molecules are involved in the electrode reaction and that the contribution of dissociated molecules is much larger than that of adsorbed ones.The electrode reaction is basically diffusion controlled and quasi-reversible.Based on the Nicholson method, the average standard heterogeneous rate constant was determined to be 1.65×10-3cm·s-1.The electrochemical activity of the Cyt c adlayer was partially lost when it was kept at 25°C for 1 h,and was completely lost at 80°C.The denatured Cyt c adlayer on a gold electrode can effectively inhibit the electrode reaction of K3Fe(CN)6solution.

Cytochrome c adlayer;Direct electrochemistry;Langmuir isothermal adsorption; Surface concentration

10.3866/PKU.WHXB201202241

?Corresponding author.Email:zhimei-qi@mail.ie.ac.cn;Tel:+86-10-58887196.

The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2009CB320300),National Natural Science Foundation of China(60978042,61078039),and BaiRenJiHua Program of ChineseAcademy of Sciences.

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項目(973)(2009CB320300),國家自然科學(xué)基金(60978042,61078039)和中國科學(xué)院“百人計劃”擇優(yōu)支持項目資助

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