劉秀勤 王德才 (哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

代謝組學(xué)〔1〕是通過(guò)考察生物體系(細(xì)胞、組織或生物體)受刺激或擾動(dòng)后(如將某個(gè)特定的基因變異或環(huán)境變化后)代謝產(chǎn)物圖譜及其動(dòng)態(tài)變化，研究生物體系的代謝網(wǎng)絡(luò)的一種技術(shù)，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的一門新興“組學(xué)”。與其他三種組學(xué)研究的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子不同，代謝組學(xué)是對(duì)生物體系中的小分子化合物進(jìn)行定性定量研究。近年來(lái)，代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用到毒理學(xué)〔2〕、營(yíng)養(yǎng)學(xué)〔3〕、植物學(xué)〔4〕、微生物學(xué)〔5〕、藥物研發(fā)〔6〕、疾病研究〔7〕、功能基因組學(xué)〔8〕等領(lǐng)域。阿爾茨海默病(AD)是一種原因不明的以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，典型病理改變?yōu)槔夏臧吆蜕窠?jīng)纖維纏結(jié)的形成。AD病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制至今仍然不明。近年來(lái)，一些學(xué)者〔9〕對(duì)AD的生物學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了研究，希望能夠找到早期診斷AD的標(biāo)志物并探明其發(fā)病機(jī)制。代謝組學(xué)運(yùn)用高通量、高敏感的分析技術(shù)，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，分析體液中的代謝產(chǎn)物，可以將所有代謝物的信息整合到一起，通過(guò)比較其代謝特性，尋找出早期敏感的生物標(biāo)志物，能夠幫助分析病變過(guò)程和輔助臨床診斷。本文就代謝組學(xué)及其在AD生物標(biāo)志物研究中的現(xiàn)狀做一綜述。

1 代謝組學(xué)的研究概況

代謝組學(xué)多應(yīng)用在藥物研發(fā)和疾病研究等領(lǐng)域研究動(dòng)物體液或組織。Fiehn等〔1〕將其定義為對(duì)限定條件下的特定生物樣品中所有代謝產(chǎn)物的定性定量分析，多應(yīng)用于植物和微生物領(lǐng)域研究細(xì)胞的代謝組學(xué)。代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)⒒蚝偷鞍踪|(zhì)表達(dá)的微小變化在代謝物上放大，從而使檢測(cè)更為容易。根據(jù)研究對(duì)象和研究目的的不同，F(xiàn)iehn〔10〕將代謝組學(xué)分為代謝物靶標(biāo)分析、代謝輪廓分析、代謝組學(xué)及代謝物指紋分析等四個(gè)層次，研究的樣品主要包括尿液、血液、唾液以及細(xì)胞或組織的提取液等。代謝組學(xué)的研究一般包括樣品的采集和制備、代謝組數(shù)據(jù)的采集、數(shù)據(jù)預(yù)處理、多變量數(shù)據(jù)分析、標(biāo)志物識(shí)別和途徑分析等步驟〔11〕。

1.1 樣品的采集及制備 在采集樣品之前，就要設(shè)計(jì)好樣本的采集時(shí)間、種類、部位、樣本量和采集樣品的器材等，并且采集樣品時(shí)要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制，盡可能在相同的條件下采集樣本，使實(shí)驗(yàn)誤差減到最小。代謝產(chǎn)物的變化會(huì)影響分析結(jié)果，處理樣品時(shí)應(yīng)抑制殘留酶的活性，避免發(fā)生氧化，采用冰凍、液氮降溫或冷凍干燥技術(shù)保存樣品〔12〕。根據(jù)研究目的和分析技術(shù)的不同，樣品預(yù)處理的方法也各不相同。磁共振(NMR)分析技術(shù)對(duì)樣品的處理比較簡(jiǎn)單，控制樣品的pH值、選用不同的緩沖液即可〔13〕。氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)技術(shù)需對(duì)揮發(fā)性較小的化合物進(jìn)行衍生化，以增加其揮發(fā)性，擴(kuò)大化合物的檢測(cè)范圍〔13〕。高效液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用技術(shù)通常根據(jù)樣品的性質(zhì)以及相似相溶原理，利用水和有機(jī)溶劑(甲醇、己烷等)分別提取，從而把非極性和極性物質(zhì)分開(kāi)〔14〕。由于特定的提取條件只適于某類化合物，目前尚無(wú)一種普適性的提取方法，故應(yīng)根據(jù)不同的化合物選擇不同的預(yù)處理方法制備樣品。

1.2 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的采集 樣本預(yù)處理后，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒z測(cè)其中的代謝產(chǎn)物，進(jìn)行代謝組數(shù)據(jù)的采集。目前多種分析技術(shù)〔15〕(色譜、質(zhì)譜、NMR、電化學(xué)、毛細(xì)管電泳等)已經(jīng)應(yīng)用到代謝組學(xué)的研究中，表1比較了代謝組學(xué)研究中常用分析技術(shù)的各自優(yōu)勢(shì)和適用范圍。其中色譜-質(zhì)譜方法兼?zhèn)渖V的高分離度、高通量及質(zhì)譜的普適性、高靈敏度和特異性，1HNMR對(duì)含氫的代謝產(chǎn)物具有普適性，因此，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和NMR技術(shù)是目前代謝組學(xué)研究中最主要的分析工具〔16〕。

表1 代謝組學(xué)研究中常用分析技術(shù)的比較

1.3 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的分析 由分析儀器獲得的元數(shù)據(jù)經(jīng)適當(dāng)?shù)念A(yù)處理〔21〕(包括濾噪、峰檢測(cè)、峰匹配、標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化和重疊峰解析等)得到大量的多維的數(shù)據(jù)信息，需進(jìn)一步借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)代謝物進(jìn)行全面分析。最常用的是模式識(shí)別技術(shù)，包括非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法〔16〕主要用于從原始譜圖信息或預(yù)處理后的信息中對(duì)樣品進(jìn)行分類，不需相關(guān)樣品分類的任何背景信息，并將獲得的分類信息與樣本的原始信息進(jìn)行比較，建立代謝產(chǎn)物與這些原始信息的聯(lián)系，篩選出相關(guān)的標(biāo)記物，考察其代謝途徑，主要包括主成分分析(PCA)〔22〕、聚類分析(CA)〔23〕、非線性映射(NLM)〔24〕等。有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法〔16〕主要用于類別間的分類，使各類樣品間達(dá)到最大的分離，并利用建立的多參數(shù)模型對(duì)未知的樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)。主要包括神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(NN)〔25〕、偏最小二乘法(PLS)〔26〕、偏最小二乘法-判別式分析(PLS-DA)〔27〕等。其中PCA和PLSDA是代謝組學(xué)研究中最常用的模式識(shí)別方法，這兩種方法通常以得分圖獲得對(duì)樣品分類的信息，載荷圖獲得對(duì)分類有貢獻(xiàn)變量及其貢獻(xiàn)大小，從而用于發(fā)現(xiàn)可作為生物標(biāo)記物的變量〔16〕。代謝組學(xué)分析還需要各種代謝途徑和生物化學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，數(shù)據(jù)庫(kù)中每種代謝產(chǎn)物都有其相應(yīng)的化學(xué)、臨床、分子生物學(xué)和生化數(shù)據(jù)〔16〕。檢索相關(guān)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，同時(shí)結(jié)合醫(yī)學(xué)生物學(xué)相關(guān)理論，向代謝終點(diǎn)的上游追溯，能夠探索出生物標(biāo)志物的代謝途徑或通路，進(jìn)而了解疾病的發(fā)病機(jī)制。一些生化數(shù)據(jù)庫(kù)〔28〕如連接圖數(shù)據(jù)庫(kù) (Connections Map DB)、京都基因與基因組百科全書 (KEGG)、METLIN、I-RIS、AraCyc、PathDB、生物化學(xué)途徑(ExPASy)、Duke博士植物化學(xué)和民族植物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)、Arizona大學(xué)天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)等，可供未知代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定或用于已知代謝物的生物功能解釋〔11〕。包含生物體代謝物組信息以及代謝物定量數(shù)據(jù)較多的數(shù)據(jù)庫(kù)有人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)、ChemSpider數(shù)據(jù)庫(kù)，但目前尚無(wú)功能完備的數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 AD概述

2009年AD國(guó)際組織發(fā)布目前全世界有3 500多萬(wàn)癡呆癥患者，未來(lái)患者人數(shù)將每20年翻一番。國(guó)際上，將老年期癡呆分為AD、血管性癡呆和混合性癡呆等，其中60% ～80%為AD患者〔29〕。AD典型病理改變?yōu)榇竽X皮層及腦區(qū)的纖維蛋白沉積，即細(xì)胞外間隙的β淀粉樣蛋白(Aβ)和細(xì)胞內(nèi)多聚Tau蛋白的沉積，兩者在病理形態(tài)學(xué)上分別表現(xiàn)為老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)。AD是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是有多種學(xué)說(shuō)〔30〕，如基因突變和多態(tài)性學(xué)說(shuō)、膽堿能假說(shuō)、tau蛋白學(xué)說(shuō)、Aβ沉積假說(shuō)、應(yīng)激適應(yīng)性衰竭假說(shuō)、自由基損害假說(shuō)、炎癥機(jī)制假說(shuō)等。

AD起病隱匿，進(jìn)展緩慢，逐漸表現(xiàn)出記憶力下降、認(rèn)知功能損害、精神行為異常等癥狀，當(dāng)出現(xiàn)明顯癡呆癥狀時(shí)臨床診斷沒(méi)有太大困難，但此時(shí)病情已無(wú)法逆轉(zhuǎn)，失去了治療時(shí)機(jī)。AD在發(fā)病早期一些分子靶標(biāo)的改變?cè)缬谄洳±砀淖?，更早于臨床癥狀的出現(xiàn)〔31〕，為此，國(guó)內(nèi)外研究者采用不同的檢測(cè)方法和技術(shù)〔32〕對(duì)AD可能的生物標(biāo)志物進(jìn)行了大量的研究，但是到目前為止，還沒(méi)有找到一種可靠的、特異的、早期敏感的AD生物標(biāo)志物，對(duì)其進(jìn)行早期診斷。生物學(xué)標(biāo)志物存在于腦脊液、血液和尿液等標(biāo)本中，其中腦脊液直接和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞外間隙相連，腦內(nèi)生物學(xué)的變化會(huì)在腦脊液中反映出來(lái)〔33〕。許多學(xué)者研究了腦脊液內(nèi)可能的標(biāo)志物，主要集中在Aβ、總Tau蛋白(T-Tau)和磷酸化Tau蛋白(P-Tau)，檢測(cè)手段多為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和蛋白組學(xué)技術(shù)〔34〕，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)來(lái)探索AD生物標(biāo)志物的研究還不多。

3 代謝組學(xué)在AD標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在臨床疾病中的應(yīng)用主要包括生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、疾病的診斷、治療和預(yù)后判斷〔35〕，但其最廣泛的應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)與疾病診斷和治療相關(guān)的代謝標(biāo)志物〔16〕。代謝組學(xué)從機(jī)體的動(dòng)態(tài)代謝途徑尋找標(biāo)志物，將基因和蛋白質(zhì)表達(dá)的微小變化在代謝物上放大，檢測(cè)患者體內(nèi)所有的小分子代謝產(chǎn)物，從而使檢測(cè)更為容易。生物標(biāo)志物是疾病預(yù)防和診斷的基礎(chǔ)，這提示可以尋找更多的標(biāo)志物達(dá)到早期診斷和早期治療的目的。近年來(lái)，隨著代謝組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展，一些學(xué)者嘗試運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)尋找能夠早期診斷AD的生物學(xué)標(biāo)志物(表2)，希望在AD發(fā)生的早期診斷出該病，加以及時(shí)的治療和干預(yù)。

表2 代謝組學(xué)分析技術(shù)在AD生物標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

4 展望

代謝組學(xué)尚處于初始階段，其分析技術(shù)還不完善，目前還未找到一致的、早期的、敏感的、特異性強(qiáng)的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)和診斷AD。今后需進(jìn)一步發(fā)展代謝組學(xué)的各種分析技術(shù)，采用多種聯(lián)合技術(shù)，通過(guò)多個(gè)角度、多個(gè)層次，篩選并解析所有的譜峰，從整體上研究機(jī)體代謝的全部過(guò)程及代謝組分，尋找高靈敏和特異的AD生物標(biāo)志物。近年來(lái)，對(duì)AD患者尿液代謝組學(xué)的研究幾乎是一片空白，利用代謝組學(xué)新的研究方法，對(duì)尿液全組分進(jìn)行分析，尋找AD早期標(biāo)志物也是其發(fā)展方向。

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