劉林，嚴(yán)紅梅 ，張赤志

(1．湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061;2．武漢市第七醫(yī)院，湖北 武漢 430064;3．湖北省中醫(yī)院肝病中心，湖北 武漢 430061)

肝細(xì)胞脂肪變性、壞死和肝組織的炎癥反應(yīng)、肝纖維化是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的主要病理特征［1］。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)具有調(diào)節(jié)脂肪代謝和調(diào)節(jié)炎癥、免疫以及細(xì)胞分化等作用，參與了NASH的發(fā)病機(jī)制［2］。筆者導(dǎo)師張赤志教授運(yùn)用溫病濕熱證理論，結(jié)合NASH的發(fā)病機(jī)理和流行病學(xué)特點(diǎn)，選用清熱化濕的代表性方劑王氏連樸飲加減治療NASH，取得較好療效。本研究旨在通過(guò)觀察加減王氏連樸飲對(duì)NASH模型大鼠PPARα mRNA表達(dá)的影響，闡明清熱化濕方防治NASH的作用機(jī)制，為本方在臨床的廣泛應(yīng)用提供客觀依據(jù)。

1 材料

1．1 藥品 加減王氏連樸飲方組:黃連3g，厚樸6g，石菖蒲3g，法半夏3g，淡豆豉9g，炒梔子9g，丹參6g，赤芍6g組成，由湖北中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂制劑室制成水煎劑，濃縮、滅菌，1.2g/mL密封包裝，置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫行?周。東寶肝泰(吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)040801)。

1．2 試劑 AST、ALT、TG，LDL試劑(南京建成生物工程研究所);PPARα原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1．3 儀器 全自動(dòng)生化檢測(cè)儀(Olympus Au560，日本);臺(tái)式高溫低速離心機(jī)(Gentrifuge5471，德國(guó));恒溫箱(S648型，上海醫(yī)療器械廠);721分光光度計(jì);恒溫箱(S648型，上海醫(yī)療器械廠);圖像分析系統(tǒng)(EagelII型，USA)。

1．4 動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，40只，雌雄各半，體質(zhì)量(170±20)g(湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

2 方法

2．1 動(dòng)物分組

所有大鼠正常喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，每組10只:正常對(duì)照組(A組)、空白模型組(B組)、加減王氏連樸飲組(C組)、東寶肝泰對(duì)照組(D組)。

2．2 模型建立及給藥

A組大鼠普通飼料正常喂養(yǎng)。B、C、D組參考鐘嵐等［3－4］報(bào)道的方法配成高脂飼料(在普通飼料基礎(chǔ)上加10%豬油、2%膽固醇)復(fù)制大鼠NASH模型。給藥8周后B、C、D組繼續(xù)用高脂飼料喂養(yǎng)同時(shí)，B組予生理鹽水10mL/kg/d灌胃，每日1次;C組予加減王氏連樸飲混懸液2.4g/kg/d灌胃(清熱化濕方相當(dāng)于成人常規(guī)劑量的1/35)，每日1次;D組予東寶肝泰混懸液0.09g/kg/d灌胃，每日1次。連續(xù)給藥4周。

2．3 取材

A組大鼠普通飼料喂養(yǎng)12周。B、C、D組給藥4周(即實(shí)驗(yàn)12周)，末次給藥后，禁食12h，處死大鼠，迅速自眼眶靜脈叢取血，常規(guī)分離血清。將肝臟4℃生理鹽水沖洗，在最大葉距邊緣5mm處取小塊肝組織。

2．4 指標(biāo)檢測(cè)

2．4．1 血清生化測(cè)定 用Olympus Au560全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TG、TCH、LDL、ALT、AST水平。

2．4．2 原位雜交技術(shù)檢測(cè)肝組織PPARα mRNA的表達(dá) 將肝組織用含4%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0－7.6，中含有1/1000 DEPC)緩沖液固定2～4h后，脫水制取石蠟切片，然后脫蠟至無(wú)水。將切片放入胃蛋白酶中，于37℃消化30min，放入用1%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0～7.6，中含有1/1000 DEPC)室溫固定10min。每張切片滴加20μl預(yù)雜交液于38～42℃置于濕盒2h，每張切片滴加20μl PPARα寡核甘酸探針雜交液于38～42℃在恒溫箱中雜交過(guò)夜。取出切片反復(fù)洗滌，滴加封閉液37℃30min，將切片與生物素化地高辛抗體37℃溫育30min。滴加SABC室溫30min，滴加生物素化過(guò)氧化物酶室溫30min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察顯色結(jié)果及掃描記錄。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍(10×40)視野，每一視野經(jīng)圖像分析系統(tǒng)讀取吸光度，將平均每視野的吸光度作為該標(biāo)本切片的代表值(MOD)，再計(jì)算出各組的均數(shù)。

PPARα寡核甘酸探針序列(靶基因 mRNA序列):

5'—AAGAGATGGGAAACATTCAAGAGAT TTCTC AGTCC—3'

5'—AGCTGTCCAGGCTCGGAGGGCTCTG TCATC ACAGA—3'

5'—ACCAG TACAG ATGAG TCCCC TGGCA ATGCA CTGAA—3'

3 結(jié)果

3．1 各組大鼠血脂和肝功能的比較 與模型組相比，東寶肝泰能明顯降低 NASH大鼠的 TG，TCH水平(P＜0.05)。加減王氏連樸飲組大鼠血清TG，TCH，ALT，AST明顯降低(P＜0.01)，作用優(yōu)于東寶肝泰組(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血脂和肝功能的比較(±s)

表1 各組大鼠血脂和肝功能的比較(±s)

注:與空白模型組比較，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01;與東寶肝泰對(duì)照組比較，3)P ＜0．05。

組別 nTG(mmol/L)TCH(mmol/L)LDL(mmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)正常對(duì)照組 10 0．25 ±0．014 1．48 ±0．15 0．19 ±0．020 67．55 ±25．02 66．73 ±30．23空白模型組 10 0．43 ±0．040 4．63 ±0．52 1．30 ±0．056 145．78 ±38．67 149．82 ±38．03加減王氏連樸飲組 10 0．30 ±0．0352，3) 3．08 ±0．642，3) 0．80 ±0．0532，3) 105．36 ±34．022，3) 110．53 ±37．652，3)東寶肝泰對(duì)照組 10 0．34 ±0．0331) 3．85 ±0．701) 0．86 ±0．0561) 138．30 ±27．671) 145．25 ±36．051)

3．2 PPARα mRNA 表達(dá)

原位雜交切片光鏡下觀察:各組大鼠肝組織切片PPARα mRNA皆有表達(dá)，于胞漿內(nèi)彌散分布(圖1)，正常組表達(dá)最明顯。圖像分析結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠肝組織PPARα mRNA表達(dá)的比較(±s)

表2 各組大鼠肝組織PPARα mRNA表達(dá)的比較(±s)

注:與空白模型組比較1)P＜0.01;與東寶肝泰組比較，2)P＞0.05。

組別 nPPARα mRNA表達(dá)(MOD)正常對(duì)照組10 0．0453 ±0．0045空白模型組 10 0．0256 ±0．0032加減王氏連樸飲組 10 0．0375 ±0．00401，2)*東寶肝泰對(duì)照組10 0．0343 ±0．0038

圖1 各組大鼠肝組織PPARα mRNA原位雜交染色

4 討論

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，有 PPARα、β(或 δ)和 γ3種亞型［5］，是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的重要因子［6］。PPARα主要分布于與脂肪酸代謝密切相關(guān)的組織如肝臟、腎臟、心臟、肌肉等，PPARα可通過(guò)3種機(jī)制調(diào)節(jié)脂肪代謝，通過(guò)與配體結(jié)合后活化而發(fā)揮作用。和配體結(jié)合后被激活的PPARα和視黃醇X受體(retinoid X receptor，RXR)形成異二聚體，再與靶基因啟動(dòng)區(qū)域的過(guò)氧化物增殖反應(yīng)元件(proxisome proliferator response element，PPRE)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用［7］。目前認(rèn)為，PPARα在脂質(zhì)代謝中起著重要調(diào)節(jié)作用。PPARα不僅能誘導(dǎo)線粒體、過(guò)氧化物酶體及微粒體氧化酶體的產(chǎn)生，還能促使參與脂肪重新合成及與糖異生相關(guān)的酶的生成，從而加速肝臟脂肪酸的氧化，減少肝臟脂肪酸的含量［8－9］。PPARα 缺乏不僅加重 TG 在肝臟的沉積，還可引起脂質(zhì)和碳水化合物的代謝紊亂。PPARα表達(dá)減少可導(dǎo)致與脂質(zhì)代謝相關(guān)的酶基因轉(zhuǎn)錄水平降低，致使脂肪酸在肝臟氧化減少，加速脂質(zhì)在肝臟沉積，從而促發(fā) NASH 的發(fā)生發(fā)展［10－11］

筆者實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NASH模型組大鼠肝組織PPARα mRNA表達(dá)明顯減弱(P＜0.01)，血清 TG、TCH、LDL、ALT、AST水平卻明顯高于正常，表明PPARα的減少導(dǎo)致肝內(nèi)脂肪酸代謝失衡，引起肝內(nèi)脂質(zhì)堆積，這可能是NASH發(fā)生的原因之一。與空白模型組相比，加減王氏連樸飲組血清TG、TCH、LDL、ALT、AST明顯降低(P＜0.01)，脂肪變性和炎癥活動(dòng)程度明顯改善(P＜0.01)，大鼠肝組織PPARα mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05)，提示加減王氏連樸飲可能通過(guò)激活 PPARα mRNA表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及其他功能發(fā)揮防治NASH的作用。

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