周 佩，梁 萍，董寶瑋，于曉玲，于 杰，徐迎新

(1.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院超聲影像科，武漢 430070;2.解放軍總醫(yī)院介入超聲科，北京 100853;3.解放軍總醫(yī)院普外研究所，北京 100853)

慢性乙肝合并肝癌患者存在多種免疫細(xì)胞功能缺陷［1］，多環(huán)節(jié)多途徑干預(yù)的免疫治療有利于提高患者總體免疫狀態(tài)、改善免疫缺陷。體外制備荷載腫瘤抗原的樹突狀細(xì)胞［2］和腫瘤抗原特異性和非特異性效應(yīng)細(xì)胞過繼免疫治療肝癌［3-4］取得一定臨床療效。局部熱消融治療小肝癌的遠(yuǎn)期療效與手術(shù)切除相當(dāng)，已被公認(rèn)為是繼手術(shù)和肝移植之后的根治性治療方法之一［5］。微波消融后，機(jī)體腫瘤負(fù)荷減輕、腫瘤對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制大大解除，同時(shí)死亡和凋亡的腫瘤細(xì)胞使腫瘤抗原得以釋放和暴露［6］，因而也是激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫的最佳時(shí)機(jī)。

本研究觀察微波消融聯(lián)合過繼細(xì)胞免疫治療乙肝后肝硬化并原發(fā)性肝癌患者的臨床安全性，以及對(duì)外周血淋巴亞群比例的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。10例原發(fā)性肝癌患者接受微波消融聯(lián)合樹突狀細(xì)胞疫苗及效應(yīng)細(xì)胞過繼免疫，納入聯(lián)合組?；颊呷虢M標(biāo)準(zhǔn)為:(1)肝內(nèi)病灶為單發(fā)結(jié)節(jié)，最大徑≤5 cm，或小于3個(gè)結(jié)節(jié)，最大徑≤3 cm;(2)無血管、膽管癌栓或肝外轉(zhuǎn)移;(3)肝功能Child分級(jí)A或B級(jí);(4)有進(jìn)針路徑，可行超聲引導(dǎo)下活檢及微波消融治療;(5)慢性乙型肝炎后肝硬化基礎(chǔ)病變;(6)肝癌病程≤3年。實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)為:血紅蛋白＞100 g/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)＞2×109/L，血小板計(jì)數(shù) ＞75×109/L，血清肌酐＜110 μmol/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶＜3倍正常上限，血清膽紅素＜2.5倍正常上限，凝血酶原時(shí)間＜19 s，HCV和HIV陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)包括:妊娠和哺乳期婦女，吸毒，精神異常，未控制的感染，全身皮質(zhì)激素治療，自身免疫性疾病，缺血性心臟病或心力衰竭，近6個(gè)月內(nèi)進(jìn)行過化療或放療的患者。

同期符合相同納入和排出標(biāo)準(zhǔn)的24位經(jīng)皮微波治療的患者納入微波組，聯(lián)合組與微波組間性別、年齡、病程分布、肝功能Child分級(jí)、病灶數(shù)目、腫瘤最大徑均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

1.2 微波消融方法

所有消融治療均在超聲引導(dǎo)下和靜脈麻醉下完成，所用麻醉劑為異丙酚和氯胺酮。微波設(shè)備為中國(guó)南京康友微波能應(yīng)用研究所研制的KY-2000(2 450 MHz)及KY-2100(915 MHz)微波消融儀，配用微波天線為15 G硬質(zhì)裂隙水冷天線，最大輸出功率為100 W;隨機(jī)配備組織測(cè)溫系統(tǒng)，連接3根21 G組織測(cè)溫針(南京康友微波能應(yīng)用研究所，中國(guó))。

表1 聯(lián)合組與微波組患者及腫瘤基礎(chǔ)特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics between combination group and PMWA group

微波治療方案設(shè)計(jì)為1次消融治療實(shí)現(xiàn)腫瘤完全滅活。根據(jù)腫瘤的大小、部位結(jié)合微波消融針熱場(chǎng)分布及操作者多年消融治療臨床經(jīng)驗(yàn)，制定每位患者及每個(gè)腫瘤病灶的消融方案［7］。一般情況下，對(duì)于直徑＜1.7 cm的腫瘤，使用單根微波天線，對(duì)于直徑≥1.7 cm的腫瘤，使用兩根微波天線，根據(jù)腫瘤大小分次布針形成組合熱場(chǎng)。瘤邊緣區(qū)植入1根測(cè)溫針，監(jiān)測(cè)瘤邊緣溫度。對(duì)于腫瘤病灶鄰近胃腸、膽囊及肝內(nèi)Glission鞘一二級(jí)分支等重要器官和結(jié)構(gòu)時(shí)，利用超聲引導(dǎo)，在腫瘤邊緣鄰近重要結(jié)構(gòu)處的肝組織內(nèi)或腫瘤邊緣組織內(nèi)放置1～2根測(cè)溫針及1～2根21G的PTC針。治療中使用微波輸出功率為40～60周，通過PTC針在治療過程中緩慢注射1～5 ml無水酒精至鄰近重要結(jié)構(gòu)處的腫瘤邊緣組織內(nèi)，并監(jiān)測(cè)測(cè)溫針?biāo)卩徑匾Y(jié)構(gòu)部位的溫度，通過停止微波發(fā)射及/或改變輸出功率控制監(jiān)測(cè)部位溫度在45℃～60℃，維持10 min。治療過程中觀察超聲及瘤邊緣溫度上升情況，要求非鄰近危險(xiǎn)部位瘤邊緣溫度達(dá)到60℃以上或54℃ 3 min以上，并且聲像圖顯示消融所致強(qiáng)回聲區(qū)完全覆蓋瘤區(qū)。微波組和聯(lián)合組患者均進(jìn)行1～2次消融治療，使用微波針數(shù)為1～4針，兩組消融治療次數(shù)和治療針數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.3 DCs和效應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)方法

免疫細(xì)胞的培養(yǎng)參照Romani等［8］報(bào)道的方法，在解放軍總醫(yī)院普外研究所GMP(Good Manufacturing Practice)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。用淋巴細(xì)胞分離液(中科院血液研究所)采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。PBMCs懸浮于10 ml DC專用培養(yǎng)基STEM-34(Gibco，美國(guó))，37℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱貼壁3 h。吸出未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞加入人重組粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(human recombinant granulocyte-macrophage colonystimulating factor，rh-GM-CSF)1000 U/ml(北京聯(lián)合藥業(yè))及人重組白細(xì)胞介素4(human recombinant interleukin 4，rh-IL-4)500 U/ml(北京聯(lián)合藥業(yè))，隔日半量換液，加入細(xì)胞因子，劑量同前。第7天收獲半量iDC細(xì)胞回輸，另半量iDC于第9天加入腫瘤抗原裂解物、BA 2.8萬粒/ml及細(xì)胞因子制備荷載腫瘤抗原的DC。未貼壁的PBMCs細(xì)胞用于制備CIK細(xì)胞，用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液KBM-551(TaKaRa，日本)重懸，加入 γ 干擾素(IFN-γ)1 000 U/ml，37 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，加入CD3單抗(北京瑞得合通公司)2 μg/ml、CD28 單抗(北京瑞得合通公司)1 μg/ml、IL-2(北京瑞得合通公司)500 U/ml，37 ℃5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。隔日添加新鮮培養(yǎng)基及IL-2，第12天收獲CIK細(xì)胞。在第二療程中，未貼壁的PBMCs細(xì)胞與第一療程中培養(yǎng)的荷載腫瘤抗原的DCs細(xì)胞共培養(yǎng)以制備CTL細(xì)胞(培養(yǎng)方法同CIK細(xì)胞)，第10天收獲。在第三療程中，在收獲和回輸?shù)那? d，CIK細(xì)胞與成熟DCs細(xì)胞以10∶1比例混合培養(yǎng)。

1.4 免疫細(xì)胞回輸前表型分析

免疫細(xì)胞回輸前，利用單抗與表面分子直接結(jié)合法，采用四色流式細(xì)胞儀 FACSCalibur(BD Biosciences)及Cell QuestPro軟件對(duì)免疫細(xì)胞特異性表面標(biāo)志分子進(jìn)行表型分析。各流式檢測(cè)管中加入細(xì)胞樣本(1 ×106)，離心 1 500 r/min，5 min，棄上清;加入1 ml的D-hanks'液洗滌，離心1 500 r/min，5 min，棄上清;加入抗體標(biāo)記樣本細(xì)胞(CD4/8/3抗體各20 μl及 CD56 抗體5 μl標(biāo)記效應(yīng)細(xì)胞，CD80/86/83及 HLA-DR 抗體各 20 μl標(biāo)記 DC)，避光40 min;加入2 ml的D-hanks'液洗滌，離心1500 r/min，5 min，棄上清，加入500 μl鞘液上機(jī)檢測(cè)分析。

1.5 免疫治療方案

免疫治療三個(gè)療程分別開始于微波治療日、微波治療后11 d和第100天，免疫細(xì)胞從患者45 ml外周血中分離和誘導(dǎo)培養(yǎng)。第一療程中，微波治療前1周，抽取患者外周血用于分離誘導(dǎo)培養(yǎng)DC及CIK細(xì)胞;微波治療前活檢，2條組織送病理檢查，3條組織用于凍融法制備自身腫瘤抗原;微波消融后2 h，行超聲造影評(píng)價(jià)消融療效排除殘存高增強(qiáng)結(jié)節(jié);在超聲造影引導(dǎo)下將21 G穿刺針引導(dǎo)至消融區(qū)與充血帶交界區(qū)后緣，局部注射半量培養(yǎng)7 d的iDC(＜2 cm結(jié)節(jié)注射4 ml，≥2 cm結(jié)節(jié)注射8 ml)，將穿刺針退至消融區(qū)與充血帶交界區(qū)前緣，注射剩余半量。微波治療后第5天，經(jīng)靜脈回輸CIK。第二療程中，微波治療后次日，抽取患者外周血用于分離培養(yǎng)制備負(fù)載腫瘤抗原的成熟DC和CTL，于微波消融后第11天回輸。成熟DCs懸浮于1 ml生理鹽水中在超聲引導(dǎo)下回輸?shù)诫p側(cè)腹股溝淋巴結(jié)(每側(cè)0.5 ml)。CTL細(xì)胞懸浮于20 ml生理鹽水中，于微波消融后第11天在超聲造影引導(dǎo)下于肝內(nèi)消融區(qū)與充血帶交界區(qū)局部回輸4 ml或8 ml(方法同iDC回輸)，剩余量在超聲引導(dǎo)下回輸?shù)接疑细垢骨粌?nèi)。第三療程中，成熟DC于培養(yǎng)后第10天回輸至腹股溝淋巴結(jié)內(nèi);DC-CIK于培養(yǎng)后第10天回輸?shù)接疑细垢骨粌?nèi)及第12天經(jīng)靜脈回輸。

1.6 外周血淋巴細(xì)胞亞群分析

患者治療前后外周血淋巴細(xì)胞表型分析用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。血樣以EDTA抗凝，各檢測(cè)管中加入相應(yīng)抗體(CD3-PerCP，CD4-FITC，CD8-FITC，CD 25 PE，CD 28 PE，CD56 PE，Mouse IgG1-FITC，Mouse IgG1-PE，Mouse IgG2a-PE，Becton Dickinson Immunocytometry Systems，BDIS，USA)，混勻，室溫暗處反應(yīng)15 min;加入2 ml FACS Lysing Solution(BDIS，USA)，混勻，室溫暗處放置10 min;3 000 r/min，離心 5 min，棄上清;洗滌，加入 300 μl 1% 多聚甲醛;2℃～8℃暗處保存，24 h內(nèi)用FACS-Calibur(Becton Dickinson，USA)檢測(cè)分析。

1.7 病理診斷、臨床觀察及隨訪

每位患者治療至少2種增強(qiáng)影像檢查考慮肝癌診斷，所有初發(fā)的肝癌患者微波治療前均行超聲引導(dǎo)下活檢，每位患者均有明確病理診斷。

微波消融治療前、消融后1、3個(gè)月及以后每3個(gè)月、1年后每6個(gè)月行實(shí)驗(yàn)室檢查及US、增強(qiáng)CT或增強(qiáng)MRI檢查。實(shí)驗(yàn)室檢查隨訪指標(biāo)包括血常規(guī)、腫瘤標(biāo)記物、肝腎功能。消融治療前1周及治療后1、3、6個(gè)月進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用CHISS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以±s表示。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析或秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn);P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 微波消融聯(lián)合過繼細(xì)胞免疫治療的安全性

聯(lián)合治療組10例患者54次細(xì)胞回輸治療未出現(xiàn)Ⅲ或Ⅳ級(jí)嚴(yán)重不良反應(yīng)，治療后主要的不良反應(yīng)為發(fā)熱及輕微乏力，15(27.78%)次細(xì)胞回輸后無任何不良反應(yīng)，39(72.22%)次細(xì)胞回輸后出現(xiàn)發(fā)熱，21次為低熱，9次出現(xiàn)38℃～39℃之間中等發(fā)熱，僅9次為39℃以上高熱。經(jīng)對(duì)癥處理，2～7 d后體溫降至正常，乏力癥狀也消失，不同細(xì)胞回輸后發(fā)熱程度及持續(xù)時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)室檢查動(dòng)態(tài)觀察6個(gè)月，臨床觀察12個(gè)月以上，未發(fā)現(xiàn)有明顯肝腎心肺、血液系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用，亦無明顯自身免疫疾病臨床表現(xiàn)。

2.2 患者外周血淋巴細(xì)胞亞群百分比的變化

治療前聯(lián)合組與微波組外周血各淋巴細(xì)胞亞群百分比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);微波組治療后1、3、6個(gè)月時(shí)外周血各淋巴細(xì)胞亞群百分比與治療前相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，聯(lián)合組患者治療前后外周血 CD3+、CD3+CD56+及 CD3-CD56+細(xì)胞亞群百分比無明顯變化，而 CD4+、CD8+、CD4+CD25high、CD8+CD28+、CD8+CD28－細(xì)胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值有較大變化。

治療后1個(gè)月，聯(lián)合組患者外周血CD4+細(xì)胞百分比降低并顯著低于微波組(P＜0.01)、CD8+細(xì)胞百分比升高并顯著高于微波組(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值降低并顯著低于微波組(P＜0.01)。聯(lián)合組患者外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞亞群較治療前顯著降低(P＜0.05)，并顯著低于微波組(P＜0.05)。聯(lián)合組原初及早期效應(yīng)細(xì)胞亞群CD8+CD28+細(xì)胞百分比較治療前升高，而微波組較治療前降低，(P＜0.01)，聯(lián)合組中晚期記憶及效應(yīng)細(xì)胞亞群CD8+CD28－細(xì)胞百分比較治療前顯著升高(P＜0.05)。

經(jīng)過兩個(gè)療程免疫治療后，第3個(gè)月時(shí)，聯(lián)合組患者外周血CD4+細(xì)胞百分比低于治療前并顯著低于微波組(P＜0.05)、CD8+細(xì)胞百分比降低僅略高于治療前，與微波組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，但CD4+/CD8+比值仍低于治療前并顯著低于微波組(P＜0.05，圖2)。聯(lián)合組患者外周血CD4+CD25+細(xì)胞亞群百分比仍顯著低于治療前(P＜0.05)，但 CD4+CD25highTreg細(xì)胞亞群百分比與微波組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。聯(lián)合組CD8+CD28+細(xì)胞亞群百分比雖已降至治療前水平但仍顯著高于微波組(P＜0.05)，且記憶及效應(yīng)細(xì)胞亞群CD8+CD28－細(xì)胞百分比仍顯著高于治療前(P＜0.05)，見表2。

表2 聯(lián)合組與微波組治療前后外周血淋巴細(xì)胞亞群比例的比較Tab.2 Comparison of the percentage of peripheral lymphocytes between combination group and PMWA group before and after treatment

經(jīng)過第三療程免疫治療，治療后6個(gè)月時(shí)，聯(lián)合組患者外周血淋巴細(xì)胞亞群CD4+/CD8+比值依然低于治療前并顯著低于微波組(P＜0.05);效應(yīng)T細(xì)胞亞群CD8+CD28+百分比再次升高，顯著高于微波組(P＜0.01)，而 CD8+CD28－、CD4+CD25+及CD4+CD25highTreg細(xì)胞亞群與治療前比較以及與微波組比較均無顯著差異。

3 討 論

目前，治療肝癌的有效方法有手術(shù)切除、局部消融和經(jīng)肝動(dòng)脈栓塞等，均能極大地減少腫瘤負(fù)荷，取得顯著的階段性臨床療效。然而，腫瘤常常在治療后1年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。既往的研究［9］表明，微波治療刺激局部免疫反應(yīng)，但持續(xù)時(shí)間較短，提示微波治療后有必要進(jìn)行免疫治療，進(jìn)一步鞏固和擴(kuò)大消融治療后減滅瘤負(fù)荷的成果，達(dá)到降低和延緩腫瘤復(fù)發(fā)的目的。根據(jù)0級(jí)動(dòng)力學(xué)原則，一定的免疫活性細(xì)胞只能殺滅一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，較少數(shù)量的腫瘤細(xì)胞能被免疫系統(tǒng)消滅，而較多的腫瘤負(fù)荷則難以抗衡。肝癌病灶微波消融后體內(nèi)大部分腫瘤細(xì)胞死亡，機(jī)體腫瘤負(fù)荷已階段性降至低谷，但病灶局部、肝內(nèi)或肝外以及血循環(huán)內(nèi)可能仍然存在少量的腫瘤細(xì)胞或微小病灶，消融后早期應(yīng)為進(jìn)行免疫治療的最佳時(shí)機(jī)。

肝癌患者多有慢性肝炎感染和肝硬化背景，機(jī)體免疫狀態(tài)復(fù)雜，肝癌消融術(shù)后即刻聯(lián)合免疫治療的治療方案尚未見報(bào)導(dǎo)，臨床治療安全性是首先必須在治療過程中觀察和證實(shí)的。本臨床初步研究結(jié)果表明微波消融后聯(lián)合樹突狀細(xì)胞疫苗及效應(yīng)細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移治療是安全的，沒有發(fā)生任何Ⅱ級(jí)以上不良反應(yīng)。主要不良反應(yīng)為發(fā)熱及輕微乏力，持續(xù)時(shí)間短，僅需對(duì)癥處理，患者完全可以耐受并不影響日?；顒?dòng)。且不同細(xì)胞回輸后發(fā)熱的程度及持續(xù)時(shí)間均無明顯差異，特別是微波聯(lián)合消融區(qū)周邊注射iDC治療后與其他免疫細(xì)胞回輸治療后發(fā)熱程度及持續(xù)時(shí)間無明顯差異，表明本臨床研究設(shè)計(jì)的免疫治療方案是安全可行的。免疫治療后隨訪12個(gè)月，患者的肝腎功能、凝血功能及血常規(guī)多個(gè)指標(biāo)均與治療前比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明免疫治療對(duì)患者肝腎功能及骨髓造血功能均無明顯影響;臨床觀察未發(fā)現(xiàn)對(duì)肺、心及神經(jīng)系統(tǒng)有影響，亦未發(fā)現(xiàn)自身免疫疾病發(fā)生，表明本臨床研究設(shè)計(jì)的微波聯(lián)合免疫治療方案是安全可行的。

消融治療后，不僅機(jī)體腫瘤負(fù)荷減輕、腫瘤對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制大大解除，同時(shí)死亡的腫瘤細(xì)胞使腫瘤抗原得以釋放和暴露，因而也是激發(fā)機(jī)體特異性抗腫瘤免疫的最佳時(shí)機(jī)。本研究在微波治療后11 d內(nèi)，設(shè)計(jì)了2個(gè)療程，綜合應(yīng)用多種免疫活性細(xì)胞通過多個(gè)途徑進(jìn)行免疫治療，利用超聲造影在消融術(shù)后早期及時(shí)、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)療效以及精確定位消融區(qū)與充血帶交界區(qū)的優(yōu)勢(shì)，將細(xì)胞回輸?shù)较趨^(qū)與充血帶交界區(qū)，將效應(yīng)細(xì)胞或荷載腫瘤抗原的成熟DC細(xì)胞在超聲引導(dǎo)下回輸?shù)礁骨粌?nèi)或淋巴結(jié)內(nèi)。利用iDC遷移及吞噬能力強(qiáng)的特點(diǎn)，將iDC回輸?shù)礁伟┎≡钕趨^(qū)局部，能高效地提呈腫瘤抗原，激發(fā)特異性抗腫瘤免疫，特別是能在消融區(qū)局部激活免疫細(xì)胞，從而改善了腫瘤病灶的局部微環(huán)境，有利于殺滅殘癌。腫瘤抗原致敏的成熟DC細(xì)胞，具有可直接向淋巴細(xì)胞遞呈腫瘤抗原的功能且遷徙能力較差，因而直接回輸?shù)搅馨拖到y(tǒng)內(nèi)能更有利于發(fā)揮其激活淋巴細(xì)胞的作用。效應(yīng)細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞的直接攻擊者，活化淋巴細(xì)胞還可釋放細(xì)胞因子，將活化淋巴細(xì)胞回輸?shù)侥[瘤局部有利于改善局部免疫微環(huán)境。因而，微波消融后多種免疫細(xì)胞綜合過繼治療有利于從多環(huán)節(jié)上改善機(jī)體免疫。

細(xì)胞免疫在抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。人類血循環(huán)中的T細(xì)胞是一群異質(zhì)細(xì)胞群，由許多表型和功能不同的亞型組成。共刺激分子CD28的表達(dá)將 T淋巴細(xì)胞分為 CD28+和 CD28－兩亞群。CD28+是表達(dá)在原初未經(jīng)抗原活化T細(xì)胞的表面分子。CD28－T細(xì)胞為CD28+T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞表面的B 7.1(CD80)和 B 7.2(CD86)配體結(jié)合后，CD28+分子表達(dá)下調(diào)而成為CD28－表型的活化的能識(shí)別抗原的效應(yīng)細(xì)胞［10］。CD4+細(xì)胞是輔助性T細(xì)胞(T helper，Th)，受抗原刺激后可誘導(dǎo)分化為Th1和Th2細(xì)胞，Th1細(xì)胞有利于誘導(dǎo)正向抗腫瘤免疫反應(yīng)，而 Th2細(xì)胞抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是潛在的免疫反應(yīng)的抑制者，是一群異質(zhì)性細(xì)胞群。既往研究表明，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞損害CD8+CTL細(xì)胞的功能，并與肝癌的侵犯轉(zhuǎn)移相關(guān)［11-12］。以往以CD4+CD25+表型細(xì)胞代表調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，但其中難以區(qū)分調(diào)節(jié)性和活化的CD4+T細(xì)胞。新近研究［15］表明，Treg主要存在于CD4+細(xì)胞中高表達(dá)CD25的細(xì)胞亞群(CD4+CD25high)［13］。因而CD8+CD28+、CD8+CD28－及CD4+CD25high淋巴細(xì)胞亞群百分比的動(dòng)態(tài)變化能反應(yīng)機(jī)體免疫狀態(tài)的改變。

研究表明，微波聯(lián)合免疫治療后明顯改善了患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的百分比和免疫狀態(tài)。聯(lián)合免疫治療后輔助T細(xì)胞亞群CD4+百分比降低、效應(yīng)細(xì)胞亞群CD8+百分比增高及CD4+/CD8+比值降低均與微波組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明免疫治療刺激了CD8+T細(xì)胞增殖，明顯改變了患者外周血細(xì)胞百分比狀態(tài)，且影響一直持續(xù)到治療后6個(gè)月;更重要的是，聯(lián)合免疫治療后外周血原初效應(yīng)細(xì)胞亞群CD8+CD28+百分比升高，顯著高于微波組，并且一直持續(xù)到治療后6個(gè)月。治療后1、3個(gè)月，聯(lián)合組CD8+CD28－細(xì)胞亞群百分比亦較治療前顯著升高，表明免疫治療不僅刺激了CD8+T細(xì)胞增殖，擴(kuò)大了效應(yīng)細(xì)胞池，而且誘導(dǎo)了腫瘤抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞，激發(fā)了機(jī)體抗腫瘤免疫機(jī)能。聯(lián)合免疫治療后1個(gè)月CD4+CD25highTreg調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群較治療前顯著降低，并顯著低于微波組，表明免疫治療明顯改善了患者的免疫抑制狀態(tài)?？傊?，治療后患者抑制免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞百分比降低，活化效應(yīng)細(xì)胞百分比升高，表明患者機(jī)體免疫狀態(tài)和免疫微環(huán)境得到了正向調(diào)節(jié)和改善，抗腫瘤免疫機(jī)能得到激發(fā)和提高。

同時(shí)也需要注意到，治療后3個(gè)月時(shí)CD8+CD28+亞群百分比較治療后1個(gè)月時(shí)降低，經(jīng)過第三療程治療后再次升高。治療后6個(gè)月時(shí)，抗原特異性效應(yīng)細(xì)胞CD8+CD28－亞群百分比較治療后1和3個(gè)月時(shí)降低。治療后3個(gè)月時(shí)CD4+CD25highT淋巴細(xì)胞亞群百分比較1個(gè)月時(shí)升高，雖仍低于治療前但與微波組已無顯著差異。經(jīng)過第三個(gè)療程的免疫治療后，6個(gè)月時(shí)CD4+CD25highT淋巴細(xì)胞亞群百分比較3個(gè)月時(shí)降低但仍高于治療后1個(gè)月，并且與微波組無顯著差異。正向和反向調(diào)節(jié)免疫的兩個(gè)淋巴細(xì)胞亞群百分比變化趨勢(shì)表明，聯(lián)合組患者前2個(gè)療程免疫治療力度大，效果較好，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，而第3個(gè)療程免疫治療后對(duì)患者外周血細(xì)胞亞群比例和免疫功能的改善效果已減弱，表明本過繼免疫治療方案改善了機(jī)體免疫狀態(tài)，但持續(xù)時(shí)間有限。

本研究表明微波消融術(shù)后早期聯(lián)合樹突狀細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞綜合過繼免疫治療肝癌是安全的，改善了患者外周血淋巴細(xì)胞比例和機(jī)體免疫狀態(tài)，其對(duì)臨床療效的影響尚需大樣本隨機(jī)試驗(yàn)及長(zhǎng)時(shí)間隨訪觀察。

［1］ Boonstra A，Woltman AM，Janssen HL.Immunology of hepatitis B and hepatitis C virus infections［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2008，22(6):1049-1061.

［2］ Lee WC，Wang HC，Hung CF，et al.Vaccination of advanced hepatocellular carcinoma patients with tumor lysate-pulsed dendritic cells:a clinical trial［J］.J Immunother，2005，28(5):496-504.

［3］ Fatourou EM，Koskinas JS.Adaptive immunity in hepatocellular carcinoma:prognostic and therapeutic implications［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2009，9(10):1499-1510.

［4］ Takayama T，Sekine T，Makuuchi M，et al.Adoptive immunotherapy to lower postsurgical recurrence rates of hepatocellular carcinoma:a randomized trial［J］.Lancet，2000，356(9232):802-807.

［5］ Bruix J，Hessheimer AJ，F(xiàn)orner A，et al.New aspects of diagnosis and therapy of hepatocellular carcinoma［J］.Oncogene，2006，25(27):3848-3856.

［6］ de Brok MH，Sutmuller RP，van der Voort R，et al.In situ tumor ablation creates an antigen source for the generation of antitumor immunity［J］.Cancer Res，2004，64(11):4024-4029.

［7］ Liang P，Dong B，Yu X，et al.Prognostic factors for survival in patients with heaptocellular carcinoma after percutaneous microwave ablation［J］.Radiology，2005，235(1):299-307.

［8］ Schuler G，Brang D，Romani N.Production and properties of large numbers of dendritic cells from human blood［J］.Adv Exp Med Biol，1995，378:43-52.

［9］ Dong BW，Zhang J，Liang P，et al.Sequential pathological and immunologic analysis of percutaneous microwave coagulation therapy of hepatocellular carcinoma［J］.Int J Hyperthermia，2003，19(2):119-133.

［10］ Tsukishiro T，Donnenberg AD，Whiteside TL.Rapid turnover of the CD8+CD28－T-cell subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer［J］.Cancer Immunol Immunother，2003，52(10):599-607.

［11］ Shen X，Li N，Li H，et al.Increased prevalence of regulatory T cells in the tumor microenvironment and itscorrelation with TNM stage of hepatocellular carcinoma［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2010，136(11):1745-1754.

［12］ Cany J，Tran L，Gauttier V，et al.Immunotherapy of hepatocellular carcinoma:is there a place for regulatory T-lymphocyte depletion?［J］.Immunotherapy，2011，3(4 Suppl):32-34.

［13］ Baecher-Allan C，Brown JA，F(xiàn)reeman GJ，et al.CD4+CD25highregulatory cells in human peripheral blood［J］.J Immunol，2001，167(3):1245-1253.