嚴(yán)興科，張 燕，于 璐，陳 程，崔海福，楊 波

(1．甘肅中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，甘肅 蘭州 730000;2．長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130117)

肺與大腸表里相合，是中醫(yī)臟腑表里相關(guān)理論的組成部分之一。肺與大腸在生理上相互聯(lián)系，病理上相互影響。有資料［1］表明，二者的密切聯(lián)系具有生物醫(yī)學(xué)依據(jù)。以往認(rèn)為肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)只在肺內(nèi)存在［2］，且有 A、B、C、D 4種亞型，其中以SP-A含量最為豐富，是降低肺泡表面張力，維持肺泡穩(wěn)定和正常的呼吸功能的重要物質(zhì)。近來發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸和小腸表面也有SP-A基因存在和蛋白表達(dá)［3］，表明腸道表面和肺表面存在密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)從針灸治療哮喘為切入點(diǎn)，觀察了哮喘大鼠肺與大腸SP-A mRNA表達(dá)改變及針刺對(duì)其的調(diào)節(jié)，為臟腑相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究和針灸效應(yīng)研究提供依據(jù)。

1 材料與動(dòng)物

1．1 動(dòng) 物

雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量(130±30)g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為20080020。

1．2 試劑與儀器

卵蛋白，OVA，美國(guó)Sigma公司進(jìn)口分裝，批號(hào)20080321;氫氧化鋁，長(zhǎng)春新華宇生物科技有限公司，批號(hào)20080626;戊巴比妥鈉，美國(guó)Sigma公司進(jìn)口分裝，批號(hào)200901111;TRIzol，美國(guó) Invitrogen公司產(chǎn)品;氯仿，北京市化工廠產(chǎn)品，批號(hào)20090121;DEPC原液，Sigma公司進(jìn)口分裝;瓊脂糖，西班牙Biowest公司產(chǎn)品;RT-PCR一步法試劑盒，美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;DNA Marker，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品;引物序列，寶生物工程大連有限公司產(chǎn)品。SMUP-B型生物信號(hào)處理系統(tǒng)，上海嘉龍教學(xué)儀器廠產(chǎn)品;呼吸流量測(cè)定系統(tǒng)，美國(guó)Kent Scientific Corporation產(chǎn)品;呼吸流量實(shí)驗(yàn)測(cè)量軟件，復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理教研室提供;Allegra X-22R低溫高速離心機(jī)，德國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品;5418小型高速離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品;TC-512 PCR擴(kuò)增儀，英國(guó)Techne公司產(chǎn)品;Cintra 202型紫外分光光度計(jì)，澳大利亞GBC公司產(chǎn)品;DYY-12C型水平電泳系統(tǒng)，北京六一儀器廠產(chǎn)品;Power Pac HV電泳儀，美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;TANNON-2010數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)及GIS凝膠圖像分析軟件，上海天能科技有限公司產(chǎn)品;Milli-DI超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1．3 分組與模型的建立

將48只SD大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、捆綁組、假手術(shù)組、哮喘模型組、原絡(luò)配穴組(太淵、偏歷)、原穴組(太淵)6組。

哮喘模型組的處理參照文獻(xiàn)方法［4］：將SD大鼠在實(shí)驗(yàn)第1天一次性向腹腔注射含卵蛋白0．250 g和氫氧化鋁凝膠0．250 g的生理鹽水1．5 mL以致敏，第15天將大鼠用5 g/L戊巴比妥鈉麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，行氣管插管術(shù)，并于頸外靜脈內(nèi)注射卵蛋白(0．250 g/kg體質(zhì)量)激發(fā)哮喘發(fā)作。原絡(luò)配穴組大鼠、原穴組大鼠第1天致敏，腹腔注射后1 h進(jìn)行針刺治療，于實(shí)驗(yàn)第15天激發(fā)哮喘發(fā)作，方法同上。假手術(shù)組大鼠于第1天腹腔注射1．5 mL生理鹽水，第15天以等量生理鹽水(1 μL/g)行頸外靜脈注射，方法同上。空白對(duì)照組大鼠不做任何處理，正常飼養(yǎng)。

1．4 穴位選取與針刺

穴位定位據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［5］確定。針刺方法：平補(bǔ)平瀉，每次留針20 min，每隔5 min行針1次，隔日針刺1次，共針7次。

原絡(luò)配穴組自實(shí)驗(yàn)第1天開始進(jìn)行針刺治療，穴位選取太淵(雙)、偏歷(雙);原穴組穴位選取太淵(雙);捆綁組自實(shí)驗(yàn)第1天起開始捆綁，不針刺，每次20 min，隔日綁1次，共捆綁7次。

1．5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1．5．1 各組大鼠總RNA樣品的制備

大鼠放血處死后，迅速在冰盤上切取肺、大腸組織。組織選取部位：肺組織——取左肺下葉肺尖(1 cm×1 cm);大腸組織——自闌門向大腸方向2．5 cm處取1 cm腸段。組織切取后用錫紙包好，迅速做好標(biāo)記放入液氮中冷凍，使液氮滲透到組織內(nèi)部而防止組織內(nèi)部發(fā)生RNA降解，后移至-80℃超低溫冰箱中保存。

用TRIzol法抽提組織中的總RNA，所得總RNA經(jīng)紫外分管光度計(jì)檢測(cè)純度及濃度。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm和280 nm的吸光度值，D260/D280的比值在1．8～2．0之間的予以保留，其余棄去不用?？?RNA原液稀釋一定比例，使樣品總RNA溶液的D260值在0．1～0．4之間，放入通光池中檢測(cè)，利用公式計(jì)算總RNA的濃度。根據(jù)所測(cè)RNA濃度調(diào)整PCR體系中總RNA的體積，使各體系所含的RNA量相同。

1．5．2 肺與大腸SP-A mRNA表達(dá)水平

引物序列設(shè)計(jì)按照參考文獻(xiàn)［6］，引物序列由寶生物工程(大連)公司合成。SP-A：5’-GGAAGCCCTGGGATCCCTGGA-3’(上游)，5’-TGGGTACCAGTTGGTGTAGT-3’(下游);GAPDH：5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG3’(上游)，5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’(下游)。以SP-A為目的基因，以GAPDH為內(nèi)參，在同一體系內(nèi)做RT-PCR基因擴(kuò)增，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將同一泳道內(nèi)的SP-A與GAPDH兩條基因表達(dá)條帶的相對(duì)密度比作為SP-A mRNA表達(dá)水平的反映。

一步法RT-PCR反應(yīng)程序：45℃逆轉(zhuǎn)錄45 min，94℃預(yù)變性 2 min，94℃變性 30 s，60℃退火1 min，延伸 68℃ 2 min，循環(huán) 40次，68℃延伸7 min，最后降至4℃結(jié)束反應(yīng)。基因擴(kuò)增結(jié)束后，取3 mL RT-PCR產(chǎn)物在經(jīng)EB染色的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓60 V，時(shí)間為100 min。

各組RNA樣品按一步法程序經(jīng)RT-PCR基因擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束將凝膠移至GIS數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)中拍照。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11．0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，多組間比較和組間兩兩比較用單因素方差分析。以P＜0．05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

肺和大腸組織中均有SP-A mRNA表達(dá)。各組中肺和大腸SP-A mRNA的表達(dá)水平由SP-A和GAPDH 2條條帶的相對(duì)密度比代表。見圖1及表1，2。

圖1 各組大鼠肺與大腸組織SP-A mRNA表達(dá)

表1 肺組織中SP-A mRNA表達(dá)水平 ±s

表1 肺組織中SP-A mRNA表達(dá)水平 ±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊P ＜0．05;與假手術(shù)組對(duì)比，###P ＜0．01;與哮喘模型組對(duì)比，△△ P＜0．05，△△△P＜0．01;與原穴組對(duì)比，＊＊P ＜0．05。

組 別 動(dòng)物數(shù) SP-A，GAPDH 相對(duì)密度比空白對(duì)照組81．204 ±0．028捆綁組 8 1．458 ±0．095＊＊假手術(shù)組 8 1．538 ±0．202＊＊哮喘模型組 8 0．920 ±0．092###原絡(luò)配穴組 8 1．215 ±0．211△△△＊＊原穴組 8 1．102 ±0．199△△

表2 大腸組織中SP-A mRNA表達(dá)水平 ±s

表2 大腸組織中SP-A mRNA表達(dá)水平 ±s

注：與空白對(duì)照組對(duì)比，＊＊P＜0．05;與假手術(shù)組對(duì)比，##P＜0．05;與哮喘模型組比較，△△P＜0．05;與原穴組對(duì)比，＊P＞0．05。

組 別 動(dòng)物數(shù) SP-A，GAPDH 相對(duì)密度比空白對(duì)照組81．592 ±0．082捆綁組 8 1．760 ±0．056＊＊#假手術(shù)組 8 1．210 ±0．103＊＊哮喘模型組 8 0．872 ±0．060##原絡(luò)配穴組 8 1．071 ±0．062△△＊原穴組 8 1．233 ±0．047△△

圖1可見，肺和大腸組織中均擴(kuò)增出目的基因SP-A和內(nèi)參GAPDH基因，且各組間SP-A基因的表達(dá)豐度存在差異。由表1可知，哮喘模型組大鼠肺組織SP-A mRNA表達(dá)水平與假手術(shù)組對(duì)比明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01);捆綁組、假手術(shù)組與空白對(duì)照組對(duì)比，肺組織SP-A mRNA的表達(dá)水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，提示捆綁束縛刺激、手術(shù)傷害性損傷等因素對(duì)大鼠肺SP-A mRNA表達(dá)有顯著影響;原絡(luò)配穴組和原穴組大鼠肺組織SPA mRN表達(dá)水平與哮喘模型組對(duì)比明顯升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．01，P ＜0．05)，且原絡(luò)配穴組大鼠肺組織SP-A mRNA表達(dá)水平高于原穴組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。提示針刺能夠明顯升高哮喘大鼠肺組織中SP-A mRNA表達(dá)水平，原絡(luò)配穴法效果優(yōu)于單純?cè)ǚㄖ委煛?/p>

由表2可知，捆綁組、假手術(shù)組大腸組織SP-A mRNA表達(dá)水平與空白對(duì)照組對(duì)比，假手術(shù)組與捆綁組對(duì)比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，提示手術(shù)傷害性損傷對(duì)大鼠大腸SP-A mRNA表達(dá)有明顯影響，手術(shù)傷害性損傷與捆綁是2種不同性質(zhì)的刺激;原絡(luò)配穴組、原穴組大鼠大腸組織SP-A mRNA表達(dá)水平與哮喘模型組對(duì)比，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，而此2組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，但以原絡(luò)配穴組升高幅度較大，提示針刺治療能夠顯著升高哮喘大鼠大腸組織SP-A mRNA的表達(dá)水平，且以原絡(luò)配穴法效果較優(yōu)。

3 討論

整體觀念是中醫(yī)學(xué)的基本特征之一，臟腑相關(guān)是其理論核心，認(rèn)為人體內(nèi)部的組織器官是相互聯(lián)系的統(tǒng)一整體［7］，并在中醫(yī)臨床實(shí)踐中發(fā)揮著至關(guān)重要的指導(dǎo)作用。中醫(yī)學(xué)關(guān)于肺和大腸關(guān)系的認(rèn)識(shí)源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《靈樞·本輸》篇稱這種關(guān)系為“肺合大腸”，《素問·血?dú)庑沃尽菲Q之為“陽明與太陰為表里”。肺與大腸通過經(jīng)絡(luò)相聯(lián)系，構(gòu)成臟腑陰陽表里的絡(luò)屬關(guān)系，構(gòu)成肺與大腸在生理、病理、治療上的相互關(guān)系。肺與大腸的上述有機(jī)聯(lián)系，是中醫(yī)學(xué)以藏象學(xué)說為核心的整體觀念的一種體現(xiàn)。

SP-A是肺表面活性物質(zhì)的重要蛋白成分，在肺泡中的功能是促進(jìn)PS在氣液界面的吸附和擴(kuò)展，協(xié)助表面活性物質(zhì)磷脂降低表面張力，調(diào)節(jié)磷脂的合成、分泌和再循環(huán)。SP-A能夠維持PS正常的結(jié)構(gòu)和代謝，表現(xiàn)為SP-A作為自身調(diào)節(jié)因子可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外的表面活性物質(zhì)水平［8］。因此，SP-A在肺中的作用之一是保證PS發(fā)揮其正常的生理功能，維持正常的呼吸運(yùn)動(dòng)。PS量的減少和SP-A、SP-B等的基因改變與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。有學(xué)者［9］測(cè)定了哮喘患者與正常人肺泡灌洗液中SP-A蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)哮喘患者肺泡灌洗液中SP-A含量明顯下降(P＜0．05)，而磷脂酰膽堿含量基本一致。

SP-A有調(diào)節(jié)炎性及過敏反應(yīng)的作用，在肺的免疫系統(tǒng)防御功能中有重要作用［10］。以往認(rèn)為，SP-A只在肺內(nèi)存在，且含量最為豐富，是降低肺泡表面張力、維持肺泡穩(wěn)定和正常的呼吸功能的重要物質(zhì)。近來發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸和小腸表面也發(fā)現(xiàn)有SP-A基因和蛋白表達(dá)存在［3］，表明腸道表面和肺表面存在密切聯(lián)系。

本次研究結(jié)果也顯示，哮喘模型組大鼠肺及大腸組織中SP-A mRNA的表達(dá)水平低于假手術(shù)組大鼠，而針刺相應(yīng)腧穴又可使肺和大腸組織中SP-A mRNA表達(dá)顯著增加，提示SP-A基因和蛋白表達(dá)可能是肺和大腸相關(guān)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)和途徑。有資料［11］表明，結(jié)腸和肺中SP-A基因序列完全相同，且這兩種器官中編碼SP-A的基因轉(zhuǎn)錄子起始于相同的位點(diǎn)，此為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中，哮喘發(fā)作時(shí)SP-A mRNA表達(dá)減少，針刺后SP-A mRNA表達(dá)增加，說明肺與大腸組織SP-A mRNA的表達(dá)減少或增加均與哮喘發(fā)病有關(guān)，SP-A可能是肺和大腸之間相互聯(lián)系的物質(zhì)基礎(chǔ)和途徑。同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示針刺提高了哮喘大鼠肺和大腸組織中SP-A mRNA的表達(dá)水平，且原絡(luò)配穴組針刺效果優(yōu)于單純?cè)ㄡ槾探M，提示針刺參與調(diào)節(jié)哮喘大鼠肺和大腸組織SP-A mRNA的表達(dá)水平，并且強(qiáng)調(diào)了表里兩經(jīng)的聯(lián)系和協(xié)同作用，而肺和大腸組織中SP-A存在的聯(lián)系機(jī)制和具體作用途徑還有待于今后更深入地研究。

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