黃鄧君(綜述)，魏煜程，沈 毅(審校)

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院胸外科，山東青島 266000)

微小核糖核酸(micro-ribonucleic acid，miRNA)是一種5'端帶磷酸基團(tuán)、3'端帶羥基，長度為18～25個核苷酸存在于真核生物中的非編碼調(diào)控RNA，現(xiàn)已證實miRNA通過與靶mRNA結(jié)合以及調(diào)節(jié)靶mRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程來調(diào)控基因的表達(dá)。既往已有關(guān)于miRNA與腫瘤之間的相關(guān)性研究，因缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/R)是器官移植術(shù)后的重要難題，故如今研究的重點已轉(zhuǎn)向miRNA參與I/R過程中細(xì)胞凋亡、增殖與分化以及炎性反應(yīng)的研究上?，F(xiàn)簡要介紹miRNA在參與I/R過程中的研究進(jìn)展，以期在分子水平上為早期診斷及干預(yù)I/R提供理論依據(jù)。

1 miRNA概述

1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn) 1993年Lee等［1］首次在秀麗隱桿線蟲發(fā)現(xiàn) miR-lin-4，隨后科學(xué)家 Reinhart等［2］在線蟲中發(fā)現(xiàn)另外一種miR-let-7。目前在人類、動植物等物種中已有8000余種miRNA被發(fā)現(xiàn)，這些miRNA的序列在進(jìn)化關(guān)系較近的物種間具有保守性，人類基因組中已確認(rèn)的有800多種，參與生命過程中的一系列重要進(jìn)程，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡［3-4］。

1.2 miRNA的形成及其作用機(jī)制 核酸酶Drosha在胞核內(nèi)加工miRNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(初miRNA)成為miRNA的前體［5］，miRNA的前體由60～90個核苷酸構(gòu)成，呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核內(nèi)的miRNA前體由Ran-GTP酶以及其受體輸出蛋白-5轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，并由胞質(zhì)中的RNaseⅢ-Dicer酶剪切出成熟的雙鏈miRNA。通常情況下，雙鏈RNA中的一條單鏈會與核糖核蛋白形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)，另一條鏈發(fā)生降解;當(dāng)然也有一些miRNA雙鏈會分別與不同的核糖核蛋白結(jié)合。RISC通過miRNA的指導(dǎo)與靶mRNA結(jié)合從而剪切靶mRNA或者抑制靶mRNA的翻譯(兩種方式)來執(zhí)行miRNA的基因沉默功能［6］。RISC與靶mRNA的結(jié)合若是部分互補(bǔ)的，則可抑制靶mRNA的翻譯;若其結(jié)合是完全互補(bǔ)的，則可降解靶mRNA。在植物中通常采用第一種方式，第二種方式通常在動物中發(fā)生。例如果蠅的let-7直接介導(dǎo)RISC剪切靶mRNA;而當(dāng)與靶mRNA不完全互補(bǔ)結(jié)合時，調(diào)節(jié)基因的表達(dá);線蟲中的1et-7與靶mRNA不完全配對結(jié)合后，抑制靶 mRNA 的翻譯［7］。Wu等［8］提出另外一種去腺苷酸化機(jī)制參與miRNA的基因調(diào)控。其依據(jù)是已知lin-28與miR-125b呈不完全互補(bǔ)方式結(jié)合，當(dāng)把miR-125b轉(zhuǎn)入人類胚胎腎細(xì)胞293T后發(fā)現(xiàn)連接了lin-28的p-球蛋白mRNA明顯縮短，這種縮短與腺苷酸的清除有關(guān)。一個miRNA可調(diào)節(jié)數(shù)個甚至數(shù)百個不同的靶mRNA，而幾種不同的miRNA也可以聯(lián)合調(diào)控單一的靶mRNA，miRNA和靶mRNA組成了復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)［9］。

1.3 miRNA的命名 miRNA的命名遵循以下制訂的幾個原則［10-11］:①miRNA簡寫成為miR，根據(jù)被克隆出來的先后順序加上阿拉伯?dāng)?shù)字，比如miR-125;②將物種縮寫置于miR的前面，比如has-miR-125;③高度同源的miRNA在數(shù)字后面加上英文小寫字母以示區(qū)分，比如miR-125a和miR-125b;④根據(jù)由不同染色體上的DNA轉(zhuǎn)錄而成的具有相同成熟體序列的miRNA，在后面再加上阿拉伯?dāng)?shù)字，比如miR-125a-1和miR-125a-2;⑤由同一前體的兩個臂分別產(chǎn)生的miRNA，根據(jù)克隆實驗表達(dá)水平較低的miR后面加*，例如miR-125a和miR-125a*，或者命名miR-125-5p(表示從5'端的臂上加工而來);⑥在規(guī)則確定之前發(fā)現(xiàn)的miRNA保留原來的名字，如let-7等。

2 I/R與肺移植

肺移植是臨床上治療終末期肺病的唯一有效手段，目前臨床上已經(jīng)成功實現(xiàn)單肺、雙肺以及心肺聯(lián)合移植。但是，肺移植術(shù)后出現(xiàn)I/R是無法避免的一個難題，也是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因之一。I/R對臟器造成的損傷機(jī)制極其復(fù)雜，包括缺血期損傷和再灌注期損傷;缺血期急性缺氧造成三磷酸腺苷的減少，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子紊亂和水解酶激活，造成組織損傷;再灌注過程中組織產(chǎn)生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，進(jìn)而加重組織損傷。ROS是I/R中主要的損傷因子，它在再灌注期損傷中扮演著激活組織中炎性細(xì)胞，釋放白細(xì)胞介素、腫瘤干擾因子等一系列炎性因子，促進(jìn)組織細(xì)胞凋亡，加重組織損傷的角色。肺移植術(shù)后早期有15%～20%的移植肺功能發(fā)生障礙，而初期發(fā)生移植肺功能障礙的主要原因是I/R，發(fā)生I/R后肺實質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，肺組織出現(xiàn)壞死，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性低氧血癥、肺順應(yīng)性減小等一系列肺功能障礙。I/R發(fā)生的病理生理貫穿于供肺的切取、保存及再灌注的整個過程。為此，人們進(jìn)行了不懈努力，主要集中于對移植肺有保護(hù)作用的物理因素(缺血預(yù)處理，氧濃度，膽堿能抗炎通路)及藥物上。從分子水平上研究肺組織I/R發(fā)生機(jī)制研究甚少。I/R的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多步驟的復(fù)雜過程。尋找發(fā)生肺組織I/R的分子機(jī)制，可為早期診斷及治療肺組織發(fā)生I/R提供理論基礎(chǔ)，甚至可為更深入地了解肺部疾病的發(fā)生機(jī)制提供研究靶點。

3 miRNA在基因表達(dá)中的調(diào)控作用

關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的研究有:Bantam是果蠅中一個能抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖的miRNA，它可抑制誘導(dǎo)果蠅細(xì)胞凋亡的Hid蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖［12］;Chan 等［13］研究表明，miRNA-21在人類惡性膠質(zhì)瘤中普遍表達(dá)，并且通過抑制miRNA-21的表達(dá)，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)目減少，而且胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7活性增加了3倍，凋亡明顯升高。關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的研究有:Cimmino等［14］發(fā)現(xiàn) miRNA-15a和 miRNA-16-1通過調(diào)控Bcl-2蛋白的表達(dá)參與細(xì)胞的凋亡過程;Alex等［15］研究指出，ROS在缺氧環(huán)境下刺激缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)上調(diào)及缺氧誘導(dǎo)的多種miRNA上調(diào)。HIF-1屬于在細(xì)胞內(nèi)氧濃度改變而引起的一系列反應(yīng)中起關(guān)鍵調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一。在缺氧情況下HIF-1降解受阻，合成增多，結(jié)果是HIF-1水平上升，轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)。同時指出在缺氧情況下，miR-210、miR-30b、miR-93、miR-181b 的表達(dá)水平發(fā)生改變，并證實它們是在缺氧情況下調(diào)節(jié)HIF-1表達(dá)的 miRNA。Ivan等［16］指出 miR-210等3種 miRNA在缺氧情況下會發(fā)生至少2倍的變化。

4 miRNA與炎性反應(yīng)

I/R 的基本特征之一是炎性反應(yīng)，已有多篇文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA與免疫、炎性反應(yīng)之間的關(guān)系［17-20］。在實驗動物的肺組織中進(jìn)行的研究有:Moschos等［21］用脂多糖建立小鼠肺部炎癥模型，注入脂多糖3 h后用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)從肺中檢測到46種 miRNA的表達(dá)改變，其中以 miR-21、miR-25、miR-27b、miR-100、miR-140、miR-142-3p、miR-181c、miR-187、miR-194、miR-214、miR-223、miR-224 等 12種miRNA表達(dá)上調(diào)尤為明顯，并與肺部浸潤的炎性細(xì)胞、細(xì)胞因子增多密切相關(guān)，提示miRNA在肺部炎性反應(yīng)種扮演重要的角色。Rodriguez等［22］研究顯示，缺乏miR-155的小鼠肺的重構(gòu)性增強(qiáng)，支氣管肺泡中白細(xì)胞數(shù)量增加，并且檢測出炎性刺激時B細(xì)胞、T細(xì)胞反應(yīng)減弱和樹突狀細(xì)胞功能下降。這證實了miR-155在調(diào)節(jié)與T細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達(dá)和炎性反應(yīng)方面有重要作用。Johnnidis等［23］以去除了編碼miR-223基因的小鼠為研究對象，觀察到了過度成熟的粒細(xì)胞表型，對外界刺激的敏感性上調(diào)，同時實驗顯示這些小鼠會產(chǎn)生自發(fā)性的肺部炎性反應(yīng)，在非致死濃度的脂多糖的刺激下即可產(chǎn)生嚴(yán)重的炎性反應(yīng)組織損傷，提示miR-223在肺組織粒細(xì)胞的炎性反應(yīng)調(diào)節(jié)中起著重要作用。在人肺泡上皮細(xì)胞中的研究有:Perry等［24］研究表明使用白細(xì)胞介素1β(interleukin-1beta，IL-1β)刺激人肺泡上皮細(xì)胞系A(chǔ)549后很快在肺泡上皮細(xì)胞中檢測到miR-146a和miR-146b這兩種miRNA的表達(dá)水平上調(diào)，但是在支氣管上皮細(xì)胞中只檢測到miR-146a上調(diào);提前用地塞米松處理的組別中仍能檢測到miR-146a和miR-146b的表達(dá)水平上調(diào)，但是其上調(diào)水平有所下降。進(jìn)一步的研究表明抑制miR-146a導(dǎo)致白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、調(diào)節(jié)正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的細(xì)胞因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES)的釋放增加，抑制miR-146b可輕微降低IL-8的產(chǎn)生，對RANTES的影響不甚明顯。而 miR-146a、miR-146b對 IL-8和RANTES的mRNA轉(zhuǎn)錄水平無影響，提示miR-146a、miR-146b在肺炎性反應(yīng)中表達(dá)上調(diào)可能是通過抑制IL-8和RANTES蛋白的翻譯過程來調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的。

5 miRNA在I/R過程中表達(dá)變化的研究進(jìn)展

5.1 miRNA在腦I/R過程中的表達(dá) Jeyaseelan等［25］在2008年通過構(gòu)建局灶性腦缺血模型，發(fā)現(xiàn)再灌注24 h 和 48 h 后，let-7、miR-7、miR-27a、miR-98、miR-137、miR-204、miR-218、miR-301、miR-338、miR-335、miR-376、miR-424 等下調(diào);miR-210、miR-215、miR-451、miR-497、miR-134等上調(diào)，同時研究證實在急性腦缺血早期主要病理變化尚未出現(xiàn)時，miRNA的表達(dá)已經(jīng)發(fā)生了明顯變化，表明miRNA在神經(jīng)系統(tǒng)缺血期的病理過程中發(fā)揮著重要作用。

5.2 miRNA在肝 I/R過程中的表達(dá) 有文獻(xiàn)報道［26］通過制作肝I/R模型，發(fā)現(xiàn)缺血2 h后miR-223表達(dá)水平與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量呈正相關(guān)。Xu等［27］隨后在缺血預(yù)處理后的肝I/R模型中檢測到78種miRNA發(fā)生了至少2倍差別的變化，其中40種下調(diào)、38種上調(diào)，與未預(yù)處理的肝 I/R 組比較，miR-23a、miR-326、miR-346、miR-370顯著表達(dá)下調(diào)，提示miRNA在肝I/R過程中同樣發(fā)揮著重要作用。

5.3 miRNA在心肌I/R過程中的表達(dá) Tang等［28］在大鼠心肌I/R模型中發(fā)現(xiàn)miR-1與Bcl-2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，同時在體外實驗中證實miR-1在缺氧環(huán)境中明顯上調(diào)，并明確了miR-1的靶基因是Bcl-2。miR-1抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)，從而在心肌細(xì)胞的凋亡中發(fā)揮作用。同年，Ren等［29］通過體內(nèi)外實驗發(fā)現(xiàn)miR-320在心肌缺血情況下表達(dá)顯著下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)miR-320過表達(dá)時心肌細(xì)胞凋亡明顯上升。潘振偉等［30］利用手術(shù)套管法建立原位大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)模型發(fā)現(xiàn)，建模4 h后I/R區(qū)心肌rno-miR-206、btalet-7g、rno-let-7c、rno-let-7f、rno-miR-1 等 5 個 miRNA表達(dá)上調(diào)，rno-miR-7d* 、rno-miR-193、rno-miR-290、rno-miR-292-5p等4個miRNA表達(dá)下調(diào)，但是miRNA在心肌I/R過程中的作用值得進(jìn)一步研究。

5.4 miRNA在腎I/R過程中的表達(dá) 吳鈺等［31］采用雙側(cè)夾閉小鼠腎蒂的方法制造急性I/R腎損傷模型，發(fā)現(xiàn)在腎I/R 4 h及24 h后miRNA-92a的表達(dá)水平顯著上調(diào)，同時提示miRNA-92a在缺血性疾病中可以誘導(dǎo)靶向血管相關(guān)因子，并且可能參與血管新生的信號途徑，促進(jìn)血管生成，提示miRNA在腎I/R過程中承擔(dān)重要的角色。

6 結(jié)語

miRNA在多種器官組織I/R過程中發(fā)揮著重要作用:一部分miRNA可能促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，另一部分miRNA可能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，加重組織的損傷。隨著目前科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的miRNA將不斷被發(fā)現(xiàn)，哪種miRNA在I/R過程中發(fā)揮哪種作用也會得以明確。相信在不久的將來，miRNA可能是早期診斷與治療I/R及其他相關(guān)疾病的非常有效的新靶點之一。

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