馮鐘煦(綜述)，劉劍勇(審校)

(廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，南寧530021)

樹突狀細胞(dendritic cells，DC)是目前人體內最活躍，功能最強大的專職抗原呈遞細胞，是人體對免疫原產(chǎn)生免疫應答的重要細胞之一。DC廣泛存在于血液、淋巴、肝脾及皮膚黏膜等組織，能激活功能性淋巴細胞，并產(chǎn)生細胞毒作用，提高機體免疫水平。DC對抗原和弱抗原都有很高的呈遞效率，只需少量的抗原及DC即可激活T細胞，因此成為抗腫瘤和抗病毒免疫研究中的熱點。

1 DC的來源與分化發(fā)育

DC的產(chǎn)生分兩個階段:從祖細胞分化為未成熟DC和未成熟DC受外界刺激(如細菌產(chǎn)物、壞死物及及各種細胞因子)分化成熟。

1.1 DC的分化 體內DC起源于多能造血干細胞，按來源其分化途徑分為兩條:①髓系分化途徑。稱為髓系DC(myebiod，DC1)，最終分化為朗格漢斯細胞和間質DC兩個亞群。DC1由髓樣干細胞在粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、腫瘤壞死因子α刺激下誘生為DC。亦有來源于外周血單核細胞，也稱為DC1前體細胞，在GM-CSF、白細胞介素4(interleukin-4，IL-4)作用下或穿越內皮細胞并吞噬異物后分化為DC。②淋巴系分化途徑。為淋巴系DC(lymphoid，DC2)，最終分化為類漿細胞DC。DC2的前體細胞不表達髓系抗原，也無吞噬、吞飲抗原能力，低表達GM-CSF，高表達 I L-3受體，在IL-3刺激下分化為DC2。目前對DC亞群及分化的研究主要來源于體外培養(yǎng)的方法，體內天然DC亞群的分類仍有待于進一步研究［1］。

1.2 DC的表型變化 DC的發(fā)育分為成熟與未成熟階段，兩者具有不同的生物學特征和細胞表型［2］。正常情況下，體內多數(shù)DC處于未成熟階段，其廣泛分布于全身各外周組織，高表達吞噬相關受體(Fc受體、補體受體、甘露糖受體)，而不表達或低表達共刺激分子和黏附分子(CD14、CD54、CD40、CD80)。未成熟DC有較強的抗原內吞和加工處理能力，而激發(fā)混合淋巴細胞反應能力較弱。經(jīng)過抗原攝取、炎性因子活化等一系列過程，DC由未成熟轉變?yōu)槌墒?，成熟DC則高表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ類分子和CD54、CD40、CD80、CD86等共刺激分子和黏附分子，CD83、CD25為成熟DC的特征性標志。成熟DC的抗原呈遞能力及體外激發(fā)混合淋巴細胞反應的能力強，而抗原攝取能力弱。DC的成熟過程同時伴有遷徙，在外周組織中攝取抗原后，通過延長樹突狀突起，改變趨化因子受體表達等方式進入淋巴結及淋巴管中成熟，并激發(fā)T細胞反應。

2 DC在免疫應答中的作用

2.1 外源性抗原的攝取與加工 未成熟DC具有極強的內吞能力，通過膜皺縮和形成大囊泡，形成液相內吞作用，可使極低濃度(10～10 mol/L)抗原得到呈遞，也可通過受體介導對糖基化抗原進行內吞。被DC攝取的抗原分子經(jīng)過MHCⅡ類途徑處理、加工成為抗原多肽，再以MHCⅡ類分子/肽復合物形式呈遞在DC表面，并可以維持較長時間(24～48 h)的免疫激發(fā)功能。未成熟DC對吞飲速度快，吞飲量大，是體內抗原的主要攝取者［3］。

2.2 DC在免疫激活的作用 攝取抗原后的DC逐漸成熟并表現(xiàn)出很強的免疫激活能力。在與T細胞的互動中，除提供MHCⅡ類分子/肽復合物的第一信號外，還高表達B7-1、B7-2、CD40分子，為T細胞提供充足第二信號，來促進T細胞的激活。實驗證明，DC還可參與B細胞的生長、分化與抗體生成。通過誘導T細胞生成B細胞刺激因子，作用于B細胞，使其分泌IgG、IgA、IgM［4］。

2.3 誘導自身免疫耐受 DC是體內唯一能激活靜息型T細胞產(chǎn)生初次免疫應答的細胞，并且能通過點狀放大刺激，激活T細胞增殖［5］。因此，在誘導T細胞活化或耐受過程中，DC發(fā)揮著十分重要的作用。未成熟DC誘導免疫激活的能力較弱。有學者推測，未成熟DC很可能在免疫耐受的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用，目前無直接證據(jù)支持這一理論。有觀點認為DC的不同成熟狀態(tài)有著不同的功能，DC的不同成熟狀態(tài)不僅決定T細胞的激活程度，而且決定T細胞的反應類型［6］。存在于非淋巴組織中(如肝、腎、皮膚、血液等)的DC是一群未成熟DC，具有極強的攝取、處理和一定的呈遞抗原能力。由于缺乏B7等共刺激分子，不能活化T細胞，反而使T細胞功能失活，誘導T細胞耐受，被認為是“耐受性DC”。

3 DC抗腫瘤免疫機制

人體的抗腫瘤免疫流程:①腫瘤相關抗原的攝取與呈遞;②激活腫瘤相關抗原特異性T細胞;③引導腫瘤相關抗原特異性T細胞至腫瘤部位，殺滅腫瘤細胞。機體抗腫瘤免疫主要依靠細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的免疫應答來殺傷腫瘤細胞，CTL并不能識別完整的腫瘤抗原分子，只能特異性地識別來源于腫瘤抗原親本、由MHC分子呈遞的抗原多肽。在大部分惡性腫瘤中，腫瘤細胞表面的MHC抗原肽、共刺激分子和黏附分子表達較低，不能有效地誘導T細胞活化，故需要抗原呈遞細胞的協(xié)同作用［7-8］。

作為體內抗原呈遞能力最強的專職抗原呈遞細胞，DC在抗腫瘤免疫中起到“中樞性”的作用，其作用的發(fā)揮依賴于以下環(huán)節(jié):DC浸潤入腫瘤組織;DC對腫瘤抗原的攝取、加工和呈遞;DC的活化以及遷移進入次級淋巴器官誘導T細胞活化。除誘導細胞免疫外，DC還可以增強體液免疫:一方面，DC通過促進抗原特異性CD4+Th的產(chǎn)生，促進抗體生成;另一方面，DC直接作用于B細胞，促進免疫球蛋白的分泌。淋巴系DC中的類漿細胞可分泌Ⅰ型干擾素，直接誘導初始和記憶B細胞分化為漿細胞，產(chǎn)生大量免疫球蛋白IgM［9］。

DC可以通過與某些腫瘤細胞相互接觸，直接抑制腫瘤細胞的生長［10］。腫瘤抗原致敏的DC可釋放一種具有抗原呈遞能力的囊泡小體exosomes，該小體內含有大量MHCⅠ、Ⅱ類分子和共刺激分子，能顯著刺激抗原特異性CD8+T細胞增殖，并誘導抗原特異性CTL反應［11］。

研究表明，在腫瘤患者體內，DC的數(shù)量下降，功能也受到了不同程度的抑制，不能有效攝取、處理、呈遞腫瘤抗原，使機體的免疫反應處于抑制狀態(tài)，從而導致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另外，DC浸潤、遷移和活化的局部微環(huán)境的變化，導致DC不能進入腫瘤組織，不能有效地識別腫瘤提供的“危險”信號。DC遷出腫瘤組織困難，會抑制DC表型和功能的成熟進程，從而抑制免疫反應的產(chǎn)生。腫瘤局部DC的數(shù)量和功能狀態(tài)與腫瘤進展部的預后明顯相關［12］，因此通過人為方法保證DC的高效運作成為腫瘤免疫治療的有效途徑。

4 DC的培養(yǎng)和DC疫苗的制備

正常人體內DC數(shù)量少，不能滿足科研和臨床的需要。體外誘導培養(yǎng)DC技術的進步使DC疫苗抗腫瘤治療成為可能。

4.1 DC的培養(yǎng) 目前用于治療的DC多來自骨髓或外周血CD34+造血祖細胞、外周血DC及單核細胞，其中以單核細胞來源的DC應用最廣。獲取DC的方法有:①將來源于骨髓或外周血CD34+造血祖細胞在體外與GM-CSF和腫瘤壞死因子α共同培養(yǎng)，獲得大量DC［13］。②單核細胞在GM-CSF和IL-4共同作用下誘導分化為未成熟DC，并在外來因素刺激下進一步分化為成熟DC［14］。③Flt3配體能動員DC進入外周血，顯著增加外周血中DC的數(shù)量，進而直接從外周血中分離純化到大量DC［15］。

另外，有研究使用臍血來源的單個核細胞制備DC［16］，即用臍血單個核細胞，在GM-CSF、IL-4和臍血中的細胞因子作用下分化成未成熟DC。該實驗用臍血漿取代腫瘤壞死因子α在較短時間內促進臍血單個核細胞分化成DC，充分利用臍血中富含的細胞因子，減少了重組細胞因子的用量，提供了一個由臍帶血制備DC的相對簡單、高效的途徑。

4.2 腫瘤抗原負載DC的方法

4.2.1 多肽類抗原負載DC 用腫瘤已知的特異性多肽物質作為抗原負載物，靶向性較好，可避免自身免疫反應的發(fā)生，較安全。莊志祥等［17］用前列腺特異性抗原、前列腺特異性膜抗原與前列腺酸性磷酸酶多肽聯(lián)合致敏自體DC治療激素難治性前列腺癌，結果明顯改善了患者免疫功能，有效激發(fā)了特異性T細胞免疫應答，病情得到控制和緩解。

4.2.2 腫瘤細胞成分負載DC 用完整腫瘤細胞作為抗原負載DC，不需要分離鑒定腫瘤抗原，且有多種抗原表位供識別。具體應用可采用腫瘤細胞裂解物、凋亡的腫瘤細胞及腫瘤mRNA來負載，也有用電融合技術將DC與腫瘤細胞融合［18］。以上負載物各具特點:①腫瘤細胞裂解物刺激DC，可有明顯的抗腫瘤效應［19］，但需要腫瘤組織多，且抗原繁多不可控，有激發(fā)自身免疫性疾病的危險。②凋亡的腫瘤細胞或凋亡的腫瘤抗原比腫瘤裂解物有更高的負載效率。李旭奎等［20］應用SACC283癌細胞凋亡抗原體外沖擊致敏的方法負載DC，并成功在體外誘導淋巴細胞介導的抗腺樣囊性癌細胞的免疫反應，證實了凋亡抗原負載DC的有效性。③腫瘤的mRNA可通過擴增技術從有限的標本得到足量的mRNA，同時可極大地避免自身抗原的混雜，防止自身免疫反應的發(fā)生。也有直接用腫瘤細胞與DC融合，所得腫瘤疫苗不僅具有完整的腫瘤抗原，而且具有呈遞細胞的特性，能夠有效呈遞腫瘤抗原給T淋巴細胞，從而激發(fā)機體產(chǎn)生特異性的抗腫瘤免疫應答。

4.2.3 抗原基因導入DC 將腫瘤抗原的基因導入DC，讓腫瘤抗原在DC內表達，進而有效激活T細胞。導入的方法主要是采用病毒載體，包括反轉錄病毒、腺病毒等。有研究證實，攜帶目的基因的重組病毒轉染的DC疫苗誘導CTL能力高于抗原肽或全抗原負載的DC［21］。其原因可能為轉染后抗原的表達在DC內部，內源性抗原更有利于DC對抗原的加工。雖然病毒殼蛋白可作為免疫原刺激DC活化，導致病毒特異性免疫應答產(chǎn)生，但病毒與宿主細胞有整合的危險，該方法尚待完善。

4.2.4 細胞因子基因導入DC DC的生長需要多種細胞因子刺激完成。負載抗原刺激DC分泌的IL-2、IL-12、腫瘤壞死因子α等細胞因子可延長DC及其誘導的CTL的壽命。向DC導入細胞因子或趨化因子的基因，可增強其抗腫瘤效應。曹大勇等［22］以反復凍融的肝癌細胞沖擊致敏IL-2基因修飾的DC，誘導出較肝癌細胞致敏DC更高水平的CTL。

5 DC疫苗治療腫瘤的研究進展與前景

從1996年首次報道DC疫苗應用于臨床免疫治療到現(xiàn)在，DC疫苗已經(jīng)在惡性淋巴瘤、惡性黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤的臨床治療中取得了較好的療效［22］。2002年DC疫苗作為腫瘤生物治療的方案通過美國食品藥品管理局批準，正式進入臨床試驗，DC疫苗的研究也展現(xiàn)了極好的發(fā)展和臨床應用前景。在我國肝癌發(fā)病率呈緩慢上升趨勢，病死率也隨之上升，占癌癥病死率的第三位，發(fā)展DC疫苗抗肝癌治療的研究具有較高的臨床價值。Palmer等［23］報道了 DC疫苗的Ⅱ期臨床試驗，對35例不適合手術的晚期肝癌患者每間隔3周注射DC疫苗，其中25例患者至少接受3次注射后評估其臨床反應。結果顯示，影像學控制率為28%，甲胎蛋白＞1000 μg/L的17例患者中有4例甲胎蛋白下降＞10%，證明了同源DC疫苗的安全性和有效性。肝癌屬于實質性腫瘤，局部免疫治療在生存期、復發(fā)率和不良反應等方面均好于系統(tǒng)免疫治療。DC瘤苗單獨治療使用很難取得理想的抗腫瘤效果，往往需要與手術、放療、化療的聯(lián)合應用，而與免疫刺激劑聯(lián)合應用也是常用方法。王志明等［24］采用腫瘤裂解抗原致敏的DC疫苗局部瘤內注射聯(lián)合應用非甲基化CpG-ODN，明顯抑制小鼠H22腫瘤的生長，說明DC疫苗對H22腫瘤有抑制作用，同時也顯示出聯(lián)合非甲基化CpG-ODN瘤內注射可進一步提高局部抗腫瘤生長作用。

大多數(shù)研究均能夠檢測到由DC瘤苗所致的抗腫瘤免疫反應，提示負載有腫瘤抗原的DC在體內是能夠表達和增強腫瘤的免疫原性，進而增強淋巴細胞的抗腫瘤作用。當然，要使DC腫瘤疫苗在臨床上廣泛應用，還存在各種各樣的問題，如制備的最優(yōu)方法以及接種的最佳程序還存在爭議;DC疫苗長期作用中有可能會誘發(fā)機體的自身免疫反應的風險;活化的T細胞不能完全滲透入腫瘤或不明原因的失活以及疫苗使用劑量、免疫頻率、療效評價等問題有待于進一步研究解決。相信隨著科研的深入及醫(yī)療技術的不斷完善，DC疫苗抗腫瘤治療會有更大的應用前景。

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