王嘯晨 張 磊 岳祥華 高志民

（1 國(guó)際竹藤中心 竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 100102 北京2 山東省龍口市園林管理處 龍口 265701 3 國(guó)際竹藤中心安徽太平試驗(yàn)中心 安徽黃山 245700）

植物彩色葉片是園林景觀中的重要組成要素之一，因其鮮艷的色彩而成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。中國(guó)竹文化歷史悠久，賞竹、詠竹早在古代就已盛行。近年來(lái)，觀賞竹因其亮麗的色彩和獨(dú)特的氣質(zhì)倍受青睞，而成為園林綠化彩葉地被、色塊或山石盆景栽觀賞的重要植物材料之一，其中地被觀葉竹種逐漸受到研究者們的關(guān)注。菲黃竹（Sasa auricoma）為禾本科赤竹屬的混生竹，是良好的地被竹種，其嫩葉純黃色具綠色條紋而頗具觀賞價(jià)值。隨著人們對(duì)菲黃竹觀賞性的認(rèn)知，對(duì)其快速繁殖[1,2]、抗逆性[3-5]、光合生理[6]、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)[7]等的研究也不斷深入，對(duì)菲黃竹在園林中的推廣應(yīng)用起到了積極的作用。然而，對(duì)于竹子葉片彩色的研究卻鮮有報(bào)道。

研究表明，植物葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其色素種類與含量是影響葉片顏色的重要因素。例如，對(duì)常見(jiàn)彩葉植物的色素組成與葉色關(guān)系的研究表明，各種色素的相對(duì)含量是導(dǎo)致葉色不同的主要原因[8]；葉綠素a的顯著減少是導(dǎo)致吊蘭色葉形成的直接原因[9]；4種李屬彩葉樹(shù)種枝葉花色苷分布的解剖研究表明，花色苷在葉片中的分布范圍與花色苷含量呈正相關(guān)[10]；對(duì)玉簪葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，隨著葉片從綠色部分-過(guò)渡色部分-黃色部分的漸變，葉綠體出現(xiàn)由橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形、基粒類囊體腫脹、囊泡產(chǎn)生和噬鋨顆粒增多的變異現(xiàn)象[11]。對(duì)白紋陰陽(yáng)竹(Hibanobambusa.tranquillans f. shiroshima)和白紋椎谷(Sasaella.glabra f. albo-striata)的研究表明，1層或2層葉肉細(xì)胞葉綠體發(fā)生變異葉色呈現(xiàn)為淺綠色的條紋，細(xì)胞內(nèi)葉綠體全部變異葉色為白色或淺黃色[12]。本研究以菲黃竹為材料，通過(guò)對(duì)其葉片色素含量的測(cè)定、解剖結(jié)構(gòu)的觀察，來(lái)探討其與葉片呈現(xiàn)顏色之間關(guān)系，以期為了解花葉竹種的成色機(jī)理，研究竹子色素代謝途徑提供參考，為竹類植物遺傳育種和品種改良提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

菲黃竹分株苗引自國(guó)際竹藤中心安徽太平試驗(yàn)中心，盆栽于國(guó)家林業(yè)局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃；光照500 μmo1/(m2?s)；光周期光/暗=16 h/8 h。

1.2 方法

1.2.1 葉片色度測(cè)定

選取生長(zhǎng)健康成熟的新鮮葉片，應(yīng)用RHSCC比色卡（英國(guó)皇家園藝協(xié)會(huì)）對(duì)葉片條紋的色度進(jìn)行測(cè)定，記錄色度值。

1.2.2 葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量測(cè)定

剪取葉片，用清水洗凈擦干，分別取葉片的綠色區(qū)和變色區(qū)部分，稱取0.2 g樣品，剪碎后放入含少量石英砂和碳酸鈣的研缽中，加入80%丙酮的15 mL，在弱光下研磨后，靜置5 min。用定性濾紙過(guò)濾，濾液定容到25 mL。應(yīng)用分光光度計(jì)（UV-3300）測(cè)定濾液在663 nm、646 nm和470 nm下的光密度值，按照文獻(xiàn)方法[13]分別計(jì)算色素含量。試驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析并作圖。

1.2.3 黃酮類物質(zhì)測(cè)定

取新鮮葉片0.2 g，用2 %甲酸（甲醇抽提黃酮類物質(zhì)）黑暗條件下4 ℃浸提24 h，每12 h振蕩一次。抽提液用定性濾紙過(guò)濾后，加入等體積石油醚萃取，1 h萃取一次，致醚相無(wú)色。極性相再用0.22 μm的尼龍微孔濾器過(guò)濾后，用于HPLC分析。層析柱使用Thermo公司的Hypersil Gold反相高效液相色譜柱，流動(dòng)相如下，A相：甲酸:水（1:9，V:V）；B相：乙腈:甲醇（85:15，V:V）。上樣后采用以下洗脫程序：0～50 min（5%～30% B相），50～60 min（30% ～5% B相）；流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μl；柱溫35 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)為525 nm和350 nm。

1.2.4 石蠟切片制作與觀察

將葉片不同條紋切成約為0.5 cm×0.5 cm小塊，迅速投入FAA固定液中，抽真空后固定48 h。按照文獻(xiàn)[14]方法脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟，用番紅-固綠雙重染色，中性樹(shù)脂封片，將樣品制成6～8 μm的切片。用光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX31）觀察葉片橫切面結(jié)構(gòu)。

1.2.5 透射電鏡樣品制作與觀察

分別取葉片的綠色區(qū)和白色區(qū)，切成1 mm×1 mm，按照文獻(xiàn)[11]方法固定、脫水、包埋、固化，使用超薄切片機(jī)（LEICA UC61）切成70 nm的切片，用3%的醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染色，利用透射電鏡（FEI Tecnai G2T）觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片色度及色素含量

應(yīng)用RHSCC比色卡測(cè)定結(jié)果顯示，菲黃竹葉片近軸面和遠(yuǎn)軸面的條紋色度存在著一定的差異，近軸面綠色區(qū)域色度為137A和144A；亮黃綠色區(qū)色度為150B；而遠(yuǎn)軸面綠色區(qū)色度為137C和141A；亮黃綠色區(qū)色度為2C。

色素含量測(cè)定結(jié)果表明，菲黃竹葉片綠色區(qū)域的葉綠素總含量為994.02 μg/g，明顯高于亮黃綠色區(qū)的含量（654.16 μg/g），但葉綠素a與葉綠素b的比值卻是亮黃綠色區(qū)高于綠色區(qū)域（表1）。類胡蘿卜素的含量綠色區(qū)域?yàn)?58.46 μg/g，亮黃綠色區(qū)域?yàn)?50.60 μg/g，差異不明顯。綠色區(qū)域葉綠素總含量與類胡蘿卜素總含量的比值為6.27:1，亮黃綠色區(qū)域?yàn)?.34:1。

表1 菲黃竹葉片不同區(qū)域葉綠素含量

反相高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果顯示，菲黃竹葉片的綠色區(qū)域葉片和變色區(qū)域在525 nm處的吸收峰最高都不超過(guò)0.005 AU，判斷其中花青素類物質(zhì)可忽略不計(jì)（圖略）；而在350 nm檢測(cè)到黃酮類物質(zhì)的組分（黃酮和黃酮醇），組分的保留時(shí)間、峰值面積都比較一致（圖1），表明綠色區(qū)域與亮黃綠色區(qū)域的黃酮類主成分基本一致，且含量差異不顯著。

圖1 菲黃竹葉片黃酮類物質(zhì)HPLC分析

2.2 葉片解剖結(jié)構(gòu)

對(duì)葉片石蠟切片觀察的結(jié)果顯示（圖2），葉片不同顏色區(qū)域的表皮細(xì)胞間沒(méi)有顯出差異，葉片上、下表皮均由1層細(xì)胞構(gòu)成，外壁有角質(zhì)層；上表皮細(xì)胞為橢圓形，大小均勻，間有3～5個(gè)并列的泡狀細(xì)胞；下表皮細(xì)胞不規(guī)則，體積較上表皮細(xì)胞略小，有較多的突起外緣，基本覆蓋整個(gè)下表面；葉緣并列有8～10個(gè)1組的泡狀細(xì)胞。葉片內(nèi)部的維管束都沒(méi)有呈現(xiàn)花環(huán)狀結(jié)構(gòu)；葉肉組織由3～4層細(xì)胞構(gòu)成，沒(méi)有柵欄組織與海綿組織的界限，內(nèi)部分布有空腔。不同顏色葉片區(qū)域的石蠟切片在組織染色后沒(méi)有出現(xiàn)差異。

圖2 竹子葉片橫切顯微結(jié)構(gòu)

超薄切片觀察表明（圖3），菲黃竹葉片不同顏色區(qū)域葉片的上表皮和下表皮中均未發(fā)現(xiàn)葉綠體，并且葉片的顏色不受表皮結(jié)構(gòu)影響，因此只對(duì)葉肉細(xì)胞進(jìn)行了超顯微觀察。超顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，葉片的綠色區(qū)域和變色區(qū)域都有完整的葉綠體，并且葉綠體類囊體排列整齊，數(shù)量上也沒(méi)有明顯差異。

圖3 菲黃竹葉綠體超微結(jié)構(gòu)

3 小結(jié)與討論

已有研究表明，植物葉片的結(jié)構(gòu)是引起葉色變化的重要因素之一，對(duì)花葉煙草(Nicotiana tabacum)的研究表明，葉片綠色部分的葉綠體結(jié)構(gòu)與野生種相似，而白色部分沒(méi)有發(fā)育為成熟的葉綠體[15]。菲黃竹葉片顏色呈現(xiàn)不同的色度，對(duì)不同顏色區(qū)域研究的結(jié)果表明：葉片綠色區(qū)域和亮黃綠色區(qū)域的組織結(jié)構(gòu)從形態(tài)上沒(méi)有差異，超微結(jié)構(gòu)顯示2部分區(qū)域的葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，說(shuō)明葉片的組織結(jié)構(gòu)不是引起葉片不同區(qū)域顏色變化的原因。

對(duì)花葉玉簪葉片綠色部分、過(guò)渡色部分和黃色部分的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a/b以及葉綠素總含量測(cè)定結(jié)果顯示，葉綠素a含量的遞減和葉綠素b含量的遞增是導(dǎo)致葉綠素a/b和葉綠素總含量遞減的原因[11]。本研究對(duì)菲黃竹葉片色素含量的測(cè)定表明，綠色區(qū)域和亮黃綠色區(qū)域的所含花青素類和黃酮類物質(zhì)趨于一致，類胡蘿卜素的含量差異不明顯，但是葉片綠色區(qū)域的葉綠素總含量明顯高于亮黃綠色區(qū)。這意味著引起菲黃竹嫩葉期葉片呈現(xiàn)不同色度的主要原因是葉片中的葉綠素含量。

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