趙綠英，劉玉玲，李金蘭，高治平，黃紅林

(南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南省高等學(xué)校藥物蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南衡陽 421001)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，As)是多種心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，其中高脂血癥是誘發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。機(jī)體長時(shí)間接觸低劑量有機(jī)磷酸酯類(organophosphorus，OP)殺蟲劑會(huì)導(dǎo)致血漿PON1活性和濃度明顯下降，也與As等疾病的發(fā)生有關(guān)［1］。敵百蟲是目前應(yīng)用最廣、接觸人數(shù)最多的一種高效、低毒的有機(jī)磷類殺蟲劑。本課題組已成功建立了低劑量敵百蟲加速家兔食餌性As模型［2］。與家兔不同，大鼠對As有很強(qiáng)的抵抗力［3］，僅用高脂飼料喂養(yǎng)等其他方法不易使大鼠形成As［4］。因此，本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠探索每日給予低劑量敵百蟲加高脂飼料建立食餌性大鼠高脂血癥模型，同時(shí)觀察染料木素(genistein，Gen)的干預(yù)效應(yīng)。

Gen是大豆植物雌激素中最主要的異黃酮，屬多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)與17β-雌二醇(estradiol，E2)相似，能選擇性結(jié)合雌激素受體產(chǎn)生與E2相似的脈管保護(hù)效應(yīng)，卻不出現(xiàn)雌激素引起生殖系統(tǒng)有關(guān)的不良反應(yīng)如女性致癌副作用和男子女性化特征等，而且具有抑制腫瘤、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松和保護(hù)心血管等多方面的藥理活性［5－6］。

利用高脂飼料喂養(yǎng)加敵百蟲腹腔注射建立大鼠高脂血癥模型以觀察Gen的調(diào)節(jié)血脂等作用及與對PON1活性及CRP濃度關(guān)系，目前未見國內(nèi)外有相似實(shí)驗(yàn)研究的報(bào)道。他汀類藥物辛伐他汀具有明顯可靠的降脂作用，對 As有很好的療效［7］，Sung等［8］利用體外實(shí)驗(yàn)證明Gen和他汀類調(diào)脂藥一樣也可以抑制羥甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶，故此實(shí)驗(yàn)選用辛伐他汀作陽性藥物對照進(jìn)一步探討Gen降脂作用機(jī)制，為Gen在心腦血管疾病防治方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠，♀♂各半，40只，2月齡，體質(zhì)量150～200 g，清潔級，購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。室溫(20～25)℃ ，相對濕度55% ～70%。大鼠用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要藥物與試劑 Gen(98%)浙大泛科(20070826)生產(chǎn);辛伐他汀(98%)湖南康普藥業(yè)股份有限公司(B2090774);丙硫氧嘧啶片，南通精華制藥股份有限公司(090202);90%敵百蟲原藥，湖南沙隆達(dá)股份有限公司(20060707001)，二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司;乙酸苯酯，北京市慶盛達(dá)化工技術(shù)有限公司;乳膠C反應(yīng)蛋白診斷試劑盒，德國羅氏診斷有限公司;微量MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所;DAB顯色試劑盒，北京中山生物技術(shù)有限公司。德國羅氏診斷有限公司TC等血脂檢測試劑盒。

敵百蟲應(yīng)用液(1%)的配制［9－10］:先配成 10%的敵百蟲母液，用新鮮且pH≤5.5的雙蒸水(高壓滅菌冷卻)溶解90%的敵百蟲原粉，渦旋混勻，過濾除菌，4℃保存。1%的敵百蟲應(yīng)用液即取10%的敵百蟲母液1 ml，用新鮮且pH≤5.5雙蒸水稀釋10倍。

1.3 儀器和器材 UV/VIS DU-640紫外分光光度儀，美國Beckman公司;H7600全自動(dòng)生化分析儀，德國羅氏公司;Nikon E200光學(xué)顯微鏡，日本Nikon公司。

2 方法

2.1 模型建立與給藥 將40只SD健康大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組:①普食組:普食喂養(yǎng)，皮下注射10%DMSO的生理鹽水(1 ml·kg－1·d－1);② 模型組;③ 低劑量Gen組;④ 高劑量Gen組;⑤辛伐他汀組;其中②～⑤均為高脂飼料喂養(yǎng)加敵百蟲腹腔注射(10 mg·kg－1·d－1)，并分別皮下注射 10%DMSO的生理鹽水(1 ml·kg－1·d－1)、低劑量Gen、高劑量Gen及辛伐他汀溶液。連續(xù)給藥并按上述飼料喂養(yǎng)8周，每2周為大鼠稱1次體重以調(diào)整給藥劑量。

2.2 血樣、標(biāo)本的采集與測定 在實(shí)驗(yàn)開始給藥前(0周)和給藥后第4、8周分別斷尾采血:大鼠禁食10 h，稱重;于次日清晨用5%水合氯醛(8 ml·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠斷尾采血，室溫靜置30 min后，3 000 r·min－1離心 30 min，收集血清，分批保存于－70℃冰箱中，備樣。

上述血標(biāo)本分別檢測大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、CRP含量、血清PON1活性、MDA濃度;全血AChE活性。

實(shí)驗(yàn)第8周末，大鼠禁食12 h，稱重;于次日清晨用5%水合氯醛(8 ml·kg－1)腹腔注射麻醉大鼠，自主動(dòng)脈瓣部至髂動(dòng)脈剝離大鼠主動(dòng)脈后，取主動(dòng)脈弓約1 cm，固定于10%的甲醛固定液中;同時(shí)取肝臟正中葉相同部位橫斷面約1 cm3，使用10%的甲醛溶液固定;上述標(biāo)本分別經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，連續(xù)切片，切片厚4 μm，HE染色使用，顯微鏡下觀察大鼠主動(dòng)脈弓及肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積等病理形態(tài)變化。

2.2.1 全血AChE活性測定 采血時(shí)留50 μl全血加以0.1%肝素鈉抗凝的采血管中，用羥肟酸鐵比色法檢測全血AChE活性［11］。

2.2.2 血脂和C-反應(yīng)蛋白檢測 取血清上樣于全自動(dòng)生化分析儀，分別采用德國羅氏診斷有限公司試劑盒檢測大鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C和CRP，并計(jì)算HDL-C/TC比值及AI值，由公式(1)計(jì)算:

2.2.3 血清PON1活性的測定 實(shí)驗(yàn)第4、8周末用乙酸苯酯法檢測血清PON1活性。測定原理是PON1可將乙酸苯酯水解為乙酸和苯酚，苯酚在270 nm波長處有強(qiáng)吸收峰，在一定濃度內(nèi)，其濃度與吸光度呈線性關(guān)系，單位時(shí)間內(nèi)生成的苯酚量可反映PON1的活性［12］。采用乙酸苯酯法檢測，以Eckerson等［13］的方法為基礎(chǔ)并稍加改進(jìn)，將乙酸苯酯加入反應(yīng)緩沖液(0.1 mmol·L－1的 Tris-HCl緩沖液，2.0 mmol·L－1的 CaCl2，pH=8.0)，于 25℃ 預(yù)溫 6 min后，加入血清樣本，反應(yīng)2 min后用乙二胺四乙酸二鈉終止反應(yīng)，然后用美國Beckman UV/VIS DU-640紫外分光光度儀于270 nm波長測定吸光度值。以不同濃度的苯酚濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的苯酚濃度的吸光度值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。按公式計(jì)算PON1活性。PON1酶活性單位定義為每分鐘催化1 μmol乙酸苯酯水解所需的酶量為1 U(kU·L－1)。

2.2.4 血清MDA含量測定 過氧化脂質(zhì)(LPO)用LPO降解產(chǎn)物MDA來衡量。采用微量MDA試劑盒，硫代巴比妥酸法檢測血清MDA含量。

2.2.5 形態(tài)學(xué)觀察 肉眼和HE染色后觀察各組大鼠主動(dòng)脈弓及肝臟病理形態(tài)學(xué)。

2.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，均以±s表示，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);方差齊者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者采用Dunnet’s T3檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀況 40只實(shí)驗(yàn)SD大鼠共35只存活至第8周末(存活率87.5%)。高脂飼料喂養(yǎng)加敵百蟲的4組中，模型組、低劑量及高劑量Gen組各1只，辛伐他汀組2只死于腹瀉，普食組1只于采血時(shí)意外死亡。每組均取6只，且♀♂各半進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

普食組大鼠毛色光澤，正常活動(dòng)，體重增長較快;高脂加敵百蟲組，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，大鼠毛色逐漸松散暗淡，活動(dòng)減少，其中各給藥組大鼠精神狀態(tài)較模型組明顯好轉(zhuǎn);體重都呈現(xiàn)先降低再增長，且實(shí)驗(yàn)期間體重變化不大。

3.2 大鼠全血AChE活性變化 實(shí)驗(yàn)第8周末各組大鼠全血AChE活性差異無顯著性，提示實(shí)驗(yàn)給SD大鼠腹腔注射10 mg·kg－1·d－1的敵百蟲并不影響全血AChE活性，達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的預(yù)期目的。

3.3 Gen 對大鼠血清 TC、TG、LDL-C、HDL-C、HDL-C/TC與AI的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Tab 1～3)可見，實(shí)驗(yàn)0周大鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量，HDL-C/TC比值與AI值各組間差異均無顯著性;第4、8周末血清TC、LDL-C含量及 AI值，相對普食組，模型組升高;相對模型組，高劑量Gen組降低，低劑量Gen有降低趨勢，但差異無顯著性;而血清TG含量，相對普食組，模型組的升高作用不明顯。相對模型組，Gen各劑量組血清TG含量降低作用不明顯。

第4周血清HDL-C含量，相對模型組，高劑量Gen組升高，而低劑量Gen組有升高趨勢，但差異無顯著性。而第8周，相對普食組，模型組升高;相對模型組，Gen各劑量組差異均無顯著性。

第4、8周，相對普食組，模型組的HDL-C/TC比值降低;相對模型組，高劑量Gen組的HDL-C/TC比值增加;而低劑量Gen增加HDL-C/TC比值差異無顯著性。

3.4 Gen對大鼠血清CRP的影響 Tab 4結(jié)果可見，0周各組大鼠血清CRP含量差異無顯著性;第4、8周末，相對普食組，模型組升高，相對模型組，Gen各劑量組均降低。

3.5 肝臟形態(tài)學(xué)變化 肝臟HE染色，光鏡下顯示:與普食組比較，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)受損，結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞均為大小不一的脂肪變性空泡(圖中箭頭所示)，部分細(xì)胞核位于邊緣;肝細(xì)胞索排列紊亂;而各給藥組大鼠肝臟形態(tài)，與模型組比較，均能在一定程度上減輕上述肝臟病變。

Fig 1 Changes of liver histomorphology(HE×400)

Fig 2 Changes of aortic histomorphology(HE×400)

Tab 1Effects of Gen on TC and TG in rat serum(±s，n=6)

Tab 1Effects of Gen on TC and TG in rat serum(±s，n=6)

*P ＜0.01 vs normal;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs model

Group TC/mmol·L －1 0 wk 4 wk 8 wk TG/mmol·L－1 0 wk 4 wk 8 wk Normal 1.44 ±0.36 1.48 ±0.13 1.40 ±0.19 0.53 ±0.20 0.57 ±0.13 0.85 ±0.20 Model 1.40 ±0.31 16.52 ±3.13＊＊ 12.27 ±1.75＊＊ 0.48 ±0.13 0.72 ±0.37 0.55 ±0.19 Gen low 1.50 ±0.37 13.23 ±4.39 9.64 ±1.93 0.50 ±0.13 0.51 ±0.25 0.41 ±0.20 Gen high 1.48 ±0.28 10.10 ±2.29△ 6.58 ±0.95△△ 0.49 ±0.16 0.45 ±0.12 0.72 ±0.25 Simvastatin 1.42 ±0.29 6.69 ±1.95△△ 5.52 ±1.43△△0.48 ±0.06 0.36 ±0.06 0.36 ±0.09

Tab 2Effects of Gen on LDL-C and HDL-C in rat serum(±s，n=6)

Tab 2Effects of Gen on LDL-C and HDL-C in rat serum(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs model

Group LDL-C/mmol·L －1 0 wk 4 wk 8 wk HDL-C/mmol·L－1 0 wk 4 wk 8 wk Normal 0.35 ±0.26 0.27 ±0.18 0.18 ±0.08 0.98 ±0.16 1.12 ±0.08 1.06 ±0.19 Model 0.33 ±0.19 14.87 ±3.07＊＊ 9.90 ±1.95＊＊ 1.01 ±0.18 1.50 ±0.20* 2.15 ±0.21＊＊Gen low 0.38 ±0.23 11.25 ±4.39 7.40 ±1.65 0.97 ±0.10 1.89 ±0.29 2.13 ±0.36 Gen high 0.35 ±0.21 7.95 ±2.25△ 4.55 ±0.79△△ 1.00 ±0.14 2.03 ±0.26△ 1.90 ±0.28 Simvastatin 0.33 ±0.16 4.93 ±1.99△△ 3.83 ±1.35△△ 1.00 ±0.17 1.67 ±0.23 1.67 ±0.09△△

Tab 3Effects of Gen on HDL-C/TC and AI in rat seurm(±s，n=6)

Tab 3Effects of Gen on HDL-C/TC and AI in rat seurm(±s，n=6)

*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01 vs normal;△P ＜0.05，△△P＜0.01 vs model

Group HDL-C/TC 0 wk 4 wk 8 wk AI 0 wk 4 wk 8 wk Normal 0.72 ±0.11 0.76 ±0.09 0.76 ±0.06 0.44 ±0.26 0.33 ±0.18 0.33 ±0.10 Model 0.73 ±0.05 0.09 ±0.02＊＊ 0.18 ±0.04＊△ 0.38 ±0.11 10.11 ±2.24＊＊ 4.77 ±1.16＊＊Gen low 0.67 ±0.11 0.15 ±0.06 0.22 ±0.02 0.58 ±0.30 6.19 ±2.50 3.34 ±0.58 Gen high 0.68 ±0.07 0.21 ±0.06△△ 0.29 ±0.04△△ 0.48 ±0.15 4.03 ±1.24△△ 2.50 ±0.43△Simvastatin 0.71 ±0.07 0.31 ±0.08△△ 0.32 ±0.06△ 0.42 ±0.14 2.44 ±1.04△△ 2.29 ±0.64△

Tab 4 Effects of Gen on CRP in rat serum(±s，n=6，×10－1mg·L－1)

Tab 4 Effects of Gen on CRP in rat serum(±s，n=6，×10－1mg·L－1)

*P＜0.05 vs normal;△P＜0.05 vs model

Group 0 wk 4 wk 8 wk Normal 1.17 ±0.41 1.17 ±0.41 1.33 ±0.52 Model 1.00 ±0.00 5.67 ±2.07* 2.00 ±0.00 Gen low 1.17 ±0.41 2.00 ±1.10 1.83 ±0.41 Gen high 1.17 ±0.41 1.50±.055△ 1.17 ±0.41△Simvastatin 1.17 ±0.41 1.33 ±0.52△ 1.17 ±0.41△

3.6 主動(dòng)脈弓形態(tài)學(xué)變化 主動(dòng)脈弓HE染色，光鏡下顯示:與普食組比較，模型組的血管壁內(nèi)膜明顯增厚，不光滑，內(nèi)皮細(xì)胞局部缺失，內(nèi)有脂質(zhì)浸潤、泡沫細(xì)胞形成，靠近內(nèi)膜的中膜平滑肌細(xì)胞增生、可見脂質(zhì)浸潤，并向內(nèi)膜遷移(圖中箭頭所示);彈力纖維層結(jié)構(gòu)不清晰，局部有斷裂現(xiàn)象，外膜有不同程度的脂質(zhì)浸潤。而各藥物組大鼠主動(dòng)脈病理形態(tài)，與模型組比較，均可在一定程度上減輕主動(dòng)脈弓病變，其中高劑量Gen組基本上恢復(fù)到普食組形態(tài)。

3.7 Gen對大鼠血清MDA含量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Tab 5，模型組血清中MDA含量增加;與模型組比較，高劑量的Gen可降低MDA水平，低劑量Gen雖有降低但差異無顯著性。

3.8 Gen對大鼠血清PON1活性的影響 Tab 5表明，第4周，相對普食組，模型組PON1降低，而相對模型組，各藥物組的PON1含量增加，說明藥物能使高脂血癥大鼠的PON1活性基本恢復(fù)到普食組水平。

而第8周，相對普食組，模型組PON1增加，原因可能是高脂飼料喂養(yǎng)的SD大鼠隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長，其HDL-C也隨著增高。相對模型組，各藥物組的PON1活性增加。進(jìn)一步說明，Gen可提高PON1活性。

Tab 5 Effects of Gen on MDA and PON1 in rat serum(±s，n=6)

Tab 5 Effects of Gen on MDA and PON1 in rat serum(±s，n=6)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs normal;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model

Group MDA/μmol·L －1 4 wk 8 wk PON1/mmol·min －1·L－1 4 wk 8 wk Normal 3.84 ±0.62 4.02 ±0.71 3.92 ±0.84 3.56 ±1.82 Model 11.60 ±2.43＊＊ 12.02 ±2.83＊＊ 1.53 ±0.83* 10.01 ±3.39 Gen low 8.61 ±1.24 9.16 ±1.79 4.25 ±2.10△ 12.28 ±4.55 Gen high 4.80±1.85△△ 5.12±1.12△ 5.22±2.47△△ 17.26±6.91△△Simvastatin 5.19 ±1.48△ 5.31 ±1.49△ 5.38 ±2.33△△ 15.11 ±3.26△

4 討論

As的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，而高脂血癥是造成As的主要原因，血液中LDL-C和TC含量的升高以及脂質(zhì)的過氧化是心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要因素。模型組SD大鼠組織病理形態(tài)結(jié)果表明高脂血癥模型復(fù)制成功，但是沒有發(fā)現(xiàn)模型組大鼠主動(dòng)脈壁形成典型的脂質(zhì)斑塊，與以往諸多研究結(jié)果一致［4，14］。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:低劑量Gen對大鼠血脂水平表現(xiàn)出降低趨勢，高劑量Gen能明顯降低食餌性高脂血癥大鼠的血脂，而且高劑量Gen能明顯降低TC和LDL-C;Gen對TG的作用尚無明顯影響，文獻(xiàn)報(bào)道也存在爭論，服用Gen或富含Gen的大豆異黃酮后檢測到血清TC與LDL-C明顯降低，而TG明顯升高［15－17］，其他研究和包括該實(shí)驗(yàn)，檢測到 Gen處理后，TG不發(fā)生改變或者對 TG沒有作用［18－20］，Lin等［21］認(rèn)為不同飲食對SD大鼠血清的TG水平影響差異具有顯著性。

Gen給藥后第4周末檢測到HDL-C作用明顯升高，而第8周末提高血清HDL-C水平上雖沒有明顯的作用，但是能使血清HDL-C/TC明顯升高，AI值明顯降低。

C-反應(yīng)蛋白(CRP)是由肝細(xì)胞產(chǎn)生與臨床炎癥有關(guān)的急性期反應(yīng)物蛋白［22］。大量證據(jù)表明 As是一種炎癥性疾病;CRP是As進(jìn)程中最主要的危險(xiǎn)標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組CRP水平呈低濃度分布，但明顯高于普食組，差異具有顯著性(P＜0.05)。高劑量Gen組和辛伐他汀組CRP水平均明顯低于模型組。結(jié)果提示，高劑量Gen和辛伐他汀均能明顯降低高脂血癥大鼠血清炎癥因子CRP水平。

MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，它的含量?？煞从硻C(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。結(jié)果可見Gen降低高脂喂養(yǎng)加敵百蟲引起的脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物MDA的含量，減少血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷而發(fā)揮抗As作用。

PON1是由肝臟產(chǎn)生、存在于HDL分子中表現(xiàn)酯酶和內(nèi)酯酶活性的一種酶。PON1能水解多種OP和神經(jīng)毒劑、多種外源性和內(nèi)源性內(nèi)酯及代謝降解LDL-C和HDL-C被氧化后的脂質(zhì)毒性。高脂飲食與敵百蟲均能引起機(jī)體PON1水平降低，導(dǎo)致機(jī)體血管內(nèi)皮損傷，促進(jìn)As病變發(fā)生［23］。Gen對血清PON1的活性影響在體內(nèi)外研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見:Gen能明顯提高大鼠血清PON1的活性，且呈現(xiàn)劑量－效應(yīng)關(guān)系。

綜上所述，Gen能明顯抑制SD大鼠高脂血癥的發(fā)生，改善其肝、主動(dòng)脈弓形態(tài)變化，此作用與Gen可逆轉(zhuǎn)血脂障礙，抑制脂質(zhì)過氧化，降低炎癥因子CRP的含量與PON1的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

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