師偉 劉瑞芬 楊曉娜 徐麗

炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中，活化內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)能激活細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子，促使更多細(xì)胞因子釋放，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。前炎癥細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的生理信使分子，當(dāng)炎癥反應(yīng)失控時(shí)損傷組織，被證實(shí)與急慢性炎癥疼痛的產(chǎn)生密切相關(guān)[1]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是具有廣泛生物活性的前炎癥細(xì)胞因子，感染、創(chuàng)傷時(shí)，TNF-α可升高[1]；作為急性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)白介素-1β（IL-1β），是啟動(dòng)抗菌炎性反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子之一[2]；白介素-8（IL-8）能幫助募集中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位、調(diào)節(jié)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[3]。因此，三者血清水平的變化，會(huì)影響機(jī)體炎癥反應(yīng)程度和性質(zhì)，從而影響慢性盆腔炎的發(fā)展和結(jié)局。本研究旨在從前炎癥細(xì)胞因子方面，探討活血化瘀法防治慢性盆腔炎的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 選擇SPF級(jí)Wistar雌性成年大鼠60只，體重（200±20）g（山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，SCXK【魯】20030004），常規(guī)飼養(yǎng)一周，適應(yīng)環(huán)境后，按體重隨機(jī)分為慢性盆腔炎造模組（模型組），桂枝茯苓膠囊治療高、中、低劑量組（高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組），少腹逐瘀膠囊治療組（對照組），各組均為12只，另選假手術(shù)慢性盆腔炎造模大鼠（假手術(shù)組）、正常飼養(yǎng)未干預(yù)大鼠（正常組）各12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

1.2.1 大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-8的ELISA檢測試劑盒（美國ADL公司生產(chǎn)）。

1.2.2 菌液配制 將大腸桿菌（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院菌種室提供）、乙型溶血性鏈球菌（山東省衛(wèi)生防疫站提供）和金黃色葡萄球菌（山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院菌種室提供）按2:1:1分別接種于血平板35 ℃，24 h后，稀釋菌液，無菌生理鹽水2 ml，分別取經(jīng)24 h培養(yǎng)的菌株數(shù)個(gè)，用標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎埽ㄏ喈?dāng)30億個(gè)菌）比濁，制成濃度30億/ml的混合細(xì)菌懸液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)藥物 桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z10950005），用蒸餾水制成31 mg/ml懸濁液；少腹逐瘀膠囊（東阿澳東藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20000085），用蒸餾水制成45 mg/ml懸濁液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法及指標(biāo)檢測 采用混合細(xì)菌加機(jī)械損傷造模法[4]，大鼠腹腔麻醉取仰臥位，取下腹正中切口1 cm，暴露并固定子宮，每側(cè)宮腔內(nèi)注入0.1 ml菌液，注入前注射器機(jī)械損傷子宮內(nèi)膜組織；假手術(shù)組動(dòng)物開腹后，雙側(cè)宮腔內(nèi)分別注入0.1 ml無菌蒸餾水關(guān)腹，術(shù)后均不使用抗生素。高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組分別按臨床2倍、1倍、1/2倍劑量，每天給予桂枝茯苓膠囊配制液502、251、125 mg/kg灌胃；對照組按臨床等效劑量，每天給予少腹逐瘀膠囊配制液364 mg/kg灌胃。模型組、假手術(shù)組、正常組予蒸餾水灌胃，每100克灌胃1 ml/d。各組均為造模后第22天開始灌胃，連續(xù)14 d。

給藥后第15天清晨禁食，1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉后，心臟取血8 ml，抗凝離心每分鐘3000 r取上清液，-30 ℃以下保存，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測血清指標(biāo)（按ELISAkit操作說明進(jìn)行）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以（±s）表示，采用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠用藥結(jié)束后血清TNF-α檢測比較 模型組血清TNF-α水平較正常組、假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；中劑量實(shí)驗(yàn)組較模型組明顯降低（P<0.01），且接近正常組水平（P>0.05），對照組較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；中劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），低劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；中劑量實(shí)驗(yàn)組血清TNF-α水平，較高、低劑量實(shí)驗(yàn)組明顯降低（P<0.01），高劑量實(shí)驗(yàn)組較低劑量實(shí)驗(yàn)組亦明顯降低（P<0.01）。見表1。

表1 各組大鼠用藥結(jié)束后血清TNF-α檢測比較

2.2 各組大鼠用藥結(jié)束后血清IL-1β檢測比較 血清IL-1β水平，模型組較正常組、假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；高、中劑量實(shí)驗(yàn)組、對照組較模型組明顯降低（P<0.01），且接近正常組水平（P>0.05）；高、中劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），低劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；高、中劑量實(shí)驗(yàn)組血清IL-1β水平，較低劑量實(shí)驗(yàn)組明顯降低（P<0.01），中劑量實(shí)驗(yàn)組較高劑量實(shí)驗(yàn)組降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組大鼠用藥結(jié)束后血清IL-1β檢測比較

2.3 各組大鼠用藥結(jié)束后血清IL-8檢測比較 模型組血清IL-8水平較正常組、假手術(shù)組明顯升高（P<0.01）；中劑量實(shí)驗(yàn)組較模型組明顯降低（P<0.01），且接近正常組水平（P>0.05）；對照組較正常組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；中劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組升高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），低劑量實(shí)驗(yàn)組較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；中劑量實(shí)驗(yàn)組血清IL-8水平，較高、低劑量實(shí)驗(yàn)組明顯降低（P<0.01），高劑量實(shí)驗(yàn)組較低劑量實(shí)驗(yàn)組亦降低（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠用藥結(jié)束后血清IL-8檢測比較

3 討論

3.1 前炎癥細(xì)胞因子對炎癥發(fā)展和結(jié)局的影響 前炎癥細(xì)胞因子廣泛參與機(jī)體免疫、炎癥、感染等反應(yīng)，影響疾病的預(yù)后，其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等是重要的前炎癥細(xì)胞因子，可觸發(fā)炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步與血小板激活因子、白三烯、氧自由基、一氧化氮等炎癥介質(zhì)共同作用，推動(dòng)疾病發(fā)生發(fā)展[5-6]。

TNF-α作為活化單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子，在感染性疾病和炎癥方面，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子、刺激單核-巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞分泌趨化性細(xì)胞因子，引起白細(xì)胞在炎癥部位聚集，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，適量TNF-α增進(jìn)機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞共同殺滅和消除入侵的致病原，過度反應(yīng)的過量TNF-α，則產(chǎn)生劇烈免疫反應(yīng)，呈現(xiàn)毒性作用，對機(jī)體造成損害[7]。IL-1β是旁分泌型細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中纖維蛋白沉積和溶解，增加成纖維細(xì)胞膠原酶的產(chǎn)生，刺激成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原沉積。Wiczyk等[8]發(fā)現(xiàn)腹部大手術(shù)后患者的早期血清IL-1、TNF-α水平與術(shù)后腸粘連、腹腔內(nèi)粘連有顯著聯(lián)系，認(rèn)為IL-1和TNF-α術(shù)后早期升高，可作為人類術(shù)后腹膜粘連形成的可靠生物學(xué)標(biāo)志。Hershlag等[9]實(shí)驗(yàn)證明，IL-1是術(shù)后腹膜粘連形成的重要短期介質(zhì)。IL-8在炎癥刺激后由巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞產(chǎn)生，主要特點(diǎn)是幫助募集中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位，調(diào)節(jié)白細(xì)胞黏附分子的表達(dá)[10]，導(dǎo)致粒細(xì)胞浸潤、聚集、黏附、脫顆粒，釋放溶酶體，呼吸爆發(fā)等，參與水腫、滲出等各種炎癥過程，與免疫性炎癥、感染性疾病、休克等密切相關(guān)[11]。

本研究結(jié)果顯示，血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平增高，與大鼠慢性盆腔炎造模密切相關(guān)，造模后37 d的模型組，三項(xiàng)指標(biāo)仍處于異常增高水平，可能反映了局部過度的炎癥反應(yīng)。藥物干預(yù)后，血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平均能降低，且降低幅度大，接近正常組指標(biāo)的組別，其子宮大體形態(tài)學(xué)、組織病理學(xué)改變越接近正常組和假手術(shù)組，這與筆者實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果較一致[12]。因此，推斷TNF-α、IL-1β、IL-8可能在慢性盆腔炎發(fā)展和結(jié)局中發(fā)揮重要作用，早期糾正其異常增高的水平，可能是防治慢性盆腔炎的重要環(huán)節(jié)之一。

3.2 活血化瘀法對前炎癥細(xì)胞因子的作用 具有活血化瘀功效的中藥方劑，能通過多環(huán)節(jié)調(diào)整炎癥發(fā)展過程，對前炎癥細(xì)胞因子的作用是其調(diào)節(jié)炎癥網(wǎng)絡(luò)因子的主要方面之一。劉淑清等[13]證實(shí)，益氣補(bǔ)腎活血方可通過抑制與骨破壞密切相關(guān)的細(xì)胞因子TNF-α和IL-1水平，可能是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制之一。胡波等[14]研究提示，活血補(bǔ)腎方通過對IL-8、SIgA分泌量的調(diào)節(jié)起到調(diào)節(jié)免疫作用，從而對ⅢA型前列腺炎大鼠起治療作用。慢性盆腔炎（CPID）是指女性盆腔生殖器官及其周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜發(fā)生的慢性炎癥性病變，西醫(yī)婦產(chǎn)科學(xué)七年制教材統(tǒng)稱為盆腔炎癥性疾病后遺癥，現(xiàn)代中醫(yī)婦科學(xué)認(rèn)為，血瘀是本病病機(jī)的關(guān)鍵所在。本研究干預(yù)藥物選用臨床確有療效的婦科經(jīng)典活血化瘀方劑桂枝茯苓膠囊、少腹逐瘀膠囊，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其作用機(jī)理與降低血清TNF-α、IL-1β、IL-8水平，使其接近正常，糾正過度炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，并與藥物劑量存在一定相關(guān)性。桂枝茯苓膠囊中劑量組（相當(dāng)于臨床用量）效果明顯，可見活血化瘀法通過下調(diào)前炎癥細(xì)胞因子，減輕和消除炎癥損傷，抑制炎癥發(fā)展可能是其防治慢性盆腔炎的主要機(jī)理之一。

下一步研究思路：一是桂枝茯苓膠囊的劑量大小與其對慢性盆腔炎大鼠血清前炎癥細(xì)胞因子降調(diào)節(jié)的程度，呈現(xiàn)非正比關(guān)系，這可能與炎癥調(diào)控平衡點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)偏倚有關(guān)，需開展更為精確的不同劑量對比實(shí)驗(yàn)及可靠性高的重復(fù)性試驗(yàn)。二是活血化瘀法防治本病血清前炎癥細(xì)胞因子之間的變化關(guān)系，也有待進(jìn)一步探討。

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