張青峰，劉詠煌

（1.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041；2.貴州省遵義醫(yī)學(xué)院珠海第五附屬（珠海）醫(yī)院，廣東 珠海 519100）

非酒精性脂肪肝（NAFLD），是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯積為特征的臨床病理綜合征。主要包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、脂肪性肝纖維化和肝硬化。NAFLD現(xiàn)已成為常見(jiàn)肝病之一，疾病隨病程的進(jìn)展表現(xiàn)不一。日益增多的資料表明，NAFLD患病率正在逐年增加，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病，是全球普遍關(guān)注的醫(yī)學(xué)問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。對(duì)于NAFLD目前沒(méi)有特效治療法。非酒精性脂肪肝其肝細(xì)胞線粒體的β氧化增加，當(dāng)消耗完體內(nèi)的抗過(guò)氧化物物質(zhì)時(shí)，就容易產(chǎn)生活性氧，氧化應(yīng)激引起的改變可能在NAFLD中起重要作用。樹(shù)莓總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化活性，能夠降低脂肪肝氧化應(yīng)激水平。本試驗(yàn)旨在用喂養(yǎng)高脂飼料的方法來(lái)建立穩(wěn)定的非酒精性脂肪肝模型，為進(jìn)一步研究樹(shù)莓總黃酮對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的防治效果做前期準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠40只（雄性），體重在160～200 g/只，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)條件為室溫22℃±1℃，濕度為55%±10%。

1.2 飼料 普通基礎(chǔ)飼料購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，高脂飼料由82.5%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油+0.5%膽酸鈉+5%蛋黃粉組成。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組 用普通基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)SD大鼠，一周后，將40只SD大鼠隨機(jī)分為兩組，其中正常對(duì)照組有10只，模型組有30只。

1.3.2 高脂飼料的制備 首先按照高脂飼料的配方比例稱(chēng)取相應(yīng)的量：普通飼料（82.5g/kg）、膽固醇（20g/kg）、豬油（100g/kg）、膽酸鈉（5g/kg）、蛋黃粉（50g/kg）。將普通基礎(chǔ)飼料粉碎，與膽固醇、膽酸鈉、蛋黃粉混勻，再加入液態(tài)的豬油混勻，最后加入適量的水，做成條狀，用烤箱在80℃溫度下烘烤至干，備用。

1.3.3 模型建立 正常對(duì)照組飼喂普通基礎(chǔ)飼料，模型組飼喂高脂飼料，每組喂養(yǎng)100g/d，自由飲水，每周稱(chēng)重一次并記錄。

1.3.4 標(biāo)本采集 大鼠飼喂12周后，取材之前空腹12h，用5%水合氯醛溶液（0.7mL/100g）將大鼠腹腔注射麻醉，固定后迅速解剖，采集心臟血5mL于抗凝管分裝并標(biāo)記，將所取的血離心（2 500 r/min，15 min）獲取血清并立即送往遵義醫(yī)學(xué)院珠海附屬醫(yī)院進(jìn)行血清指標(biāo)檢測(cè)。取出肝臟，用生理鹽水沖洗干凈后置于10%甲醛中保存待檢。

1.3.5 肝臟病理學(xué)觀察 采血后將大鼠肝臟取出，觀察肝臟的大小、形狀、顏色，并詳細(xì)記錄觀察結(jié)果。然后從肝小葉上切取一塊肝組織（大約1 cm×1 cm×0.2～0.3 cm）置于10%福爾馬林溶液中固定24h左右，制作成石蠟切片，染色后在顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示。P＜0.05表示差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠肝臟的一般情況 正常對(duì)照組的肝組織形態(tài)正常，顏色鮮紅，表面光滑，邊緣銳利，質(zhì)地紅潤(rùn)柔軟。模型組的肝臟體積明顯增大，重量也比正常對(duì)照組重，顏色呈棕黃色，肝葉粘連，肝臟切面油膩。

2.2 肝臟指數(shù) 正常對(duì)照組和模型組的體重、肝濕重、肝指數(shù)（肝重/體重）結(jié)果見(jiàn)表1。與正常對(duì)照組相比，模型組體重?zé)o明顯變化（P＞0.05），肝濕重和肝指數(shù)顯著增高（P＜0.01）。

表1 SD大鼠的體重、肝濕重、肝指數(shù)比較

2.3 血清指標(biāo) 模型組血清指標(biāo)TC、TG、ALT、AST、HDL-C、LDL-C含量變化與正常對(duì)照組的對(duì)比情況見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，模型組與對(duì)照組相比血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C水平顯著升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；模型組HDL-C水平低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 大鼠各血清指標(biāo)比較

圖1 模型組肝組織鏡檢觀察結(jié)果

2.4 肝臟病理學(xué)改變 由病理照片（圖1和圖2）可見(jiàn)，正常對(duì)照組的肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞無(wú)脂肪變性，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央；模型組的肝細(xì)胞體積增大，有大量的空泡狀細(xì)胞，肝細(xì)胞脂肪變性明顯，細(xì)胞核被擠向一邊，部分細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變。按照病理學(xué)對(duì)脂肪肝的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將脂肪肝分為輕度、中度和重度：低倍鏡下，肝細(xì)胞脂肪變性占肝小葉1/3～1/2者為輕度脂肪肝；占肝小葉1/2～2/3者為中度脂肪肝；占肝小葉2/3以上或者肝細(xì)胞彌漫脂肪性變性呈漁網(wǎng)狀者為重度脂肪肝。模型組大鼠的脂肪變性都在中度脂肪肝以上。

圖2 正常對(duì)照組肝組織鏡檢觀察結(jié)果

3 討論

非酒精性脂肪肝是指除酒精以外的各種原因引起的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積過(guò)多的病變，主要病因是由于過(guò)多攝入熱量，身體肥胖所致，用高脂飼料造模就是利用了這個(gè)原理。從試驗(yàn)結(jié)果看，模型組大鼠的肝臟指數(shù)——肝濕重、肝指數(shù)都明顯高于正常對(duì)照組。從病理學(xué)角度觀察看，模型組大鼠的肝臟呈棕黃色，切面油膩，肝細(xì)胞體積明顯增大，細(xì)胞核被擠到一邊，有大量空泡狀細(xì)胞，具備人類(lèi)脂肪肝特征。這些都說(shuō)明改良的高脂飲食造模成功。

本試驗(yàn)通過(guò)飼喂大鼠高脂飼料成功地建立了動(dòng)物非酒精性脂肪肝模型，在造模12周后，模型組的血清指標(biāo) TC、TG、ALT、AST、LDL-C 明顯高于正常對(duì)照組，HDL-C明顯低于正常對(duì)照組，說(shuō)明檢測(cè)血清TC、TG、ALT、AST、LDL-C、HDL-C 等指標(biāo)在一定程度上可以反映非酒精性脂肪肝的病變程度。

飼喂大鼠高脂飼料成功地建立了非酒精性脂肪肝模型，說(shuō)明本試驗(yàn)所用的高脂飼料配方對(duì)于建立非酒精性脂肪肝模型是可行的，但也有一定的問(wèn)題。因飼料中摻入了膽固醇、豬油等油膩物質(zhì)，使飼料性質(zhì)發(fā)生改變，且有異味，動(dòng)物易出現(xiàn)“厭食”或腹瀉；另外，造模所需的時(shí)間長(zhǎng)、病變輕。然而由于該模型制作方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、價(jià)格低廉、動(dòng)物死亡率低、復(fù)制率高，病變有漸進(jìn)性發(fā)展過(guò)程，造模停止后病變逆轉(zhuǎn)緩慢便于藥物干預(yù)研究，因此仍然是國(guó)內(nèi)外最常用的脂肪肝模型。

4 結(jié)論

通過(guò)改良的高脂飼料飼喂SD大鼠12周后，進(jìn)行病理學(xué)觀察和血清指標(biāo)檢測(cè)，證明SD大鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功，可以為后續(xù)研究奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

[1] 翁小剛，朱曉新，楊慶，等.非酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009,15（11）：104-108.

[2] 孫風(fēng)霞，張妹媛，王憲波，等.清肝化痰活血方對(duì)大鼠非酒精性脂肪肝的防治研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21（11）：2851-2853.

[3] 林瑋，徐柯，鄭海英，等.粗葉懸鉤子總生物堿治療大鼠非酒精性脂肪肝的實(shí)驗(yàn)研究[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，21（4）：31-34.

[4] 南月敏，王蕾，李良宵，等.非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28（1）：67-69.

[5] 李明霞，任伯緒，王昌富，等.非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型建立及相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（2）：95-99.