羅建勛，董 昕，辜云杰

(1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川成都 610081;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，四川雅安 625014)

云杉屬(Picea Dietr.)植物歷史悠久，全世界約有40種［1］。據(jù)古氣候?qū)W和古環(huán)境學(xué)研究證實(shí)，云杉屬植物早在白堊紀(jì)就在地球上有分布，后經(jīng)地質(zhì)變遷，形成了現(xiàn)今的分布格局，即主要分布在北緯50°～60°的寒溫帶或凍原地帶，少數(shù)分布在溫帶和亞熱帶的濕冷亞高山帶上。云杉屬植物因其樹干通直圓滿，材質(zhì)好，出材率高，而且適生性強(qiáng)，現(xiàn)已成為西歐、北歐、波羅的海沿岸國(guó)家、俄羅斯和加拿大的重要造林樹種與工業(yè)用材林樹種。同時(shí)，云杉屬樹種高度異交，雜合度較高，其天然群體具有豐富的遺傳多樣性，所以是研究遺傳變異的好材料，通過(guò)發(fā)掘變異和利用遺傳變異，達(dá)到林木遺傳改良和種質(zhì)資源保存的目的。迄今為止，對(duì)云杉屬遺傳變異的研究先后經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、同工酶標(biāo)記和DNA標(biāo)記4個(gè)階段，目前以DNA分子水平的研究為熱點(diǎn)。DNA標(biāo)記技術(shù)起源于20世紀(jì)70年代的西歐，而后迅速發(fā)展，被各地廣泛應(yīng)用，尤其是21世紀(jì)頭10a，該項(xiàng)技術(shù)更加推動(dòng)了國(guó)外云杉屬植物遺傳多樣性研究在分子水平上的發(fā)展，并取得了卓有成效的成果。然而，我國(guó)云杉資源豐富，但DNA分子標(biāo)記方面的研究起步較晚，有待進(jìn)一步發(fā)展。就論文發(fā)表情況而言，僅在1990年～2000年間，曾見羅建勛［2］、張含國(guó)［3］、王芋華［4］等少數(shù)幾個(gè)人對(duì)國(guó)外云杉遺傳多樣性進(jìn)行過(guò)詳細(xì)論述。綜上，有必要對(duì)2000年～2010年國(guó)外云杉屬植物天然群體的DNA標(biāo)記進(jìn)行綜述。

1 DNA標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在云杉屬樹種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、種的鑒定與親緣關(guān)系分析和基因表達(dá)分析等方面得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是在遺傳多樣性與遺傳分化分子水平的研究必不可少，已經(jīng)從核DNA研究擴(kuò)展到覆蓋線粒體DNA(mtDNA)和葉綠體 DNA(cpDNA)的研究。例如Maghuly等［5］開發(fā)了挪威云杉(Picea abies)群體的線粒體遺傳標(biāo)記。眾所周知，種群是物種進(jìn)化的基本單位，群體在自然界中有其特定的分布格局式樣，所以研究遺傳多樣性不僅要分析遺傳變異的高低，還要了解遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布式樣以及在時(shí)間上的變化，即遺傳結(jié)構(gòu)。然而，云杉屬樹種的基因組較大，2C=29 ×109bp［6］，且 70%是非編碼區(qū)，基因的表達(dá)尚不清楚，對(duì)基因組的量化描述也存在局限性，因此，利用DNA標(biāo)記對(duì)云杉屬的變異進(jìn)行定量分析，可以追尋其進(jìn)化規(guī)律的蹤跡，從而能更好地利用現(xiàn)存云杉遺傳材料。根據(jù)各種標(biāo)記的開發(fā)基礎(chǔ)，主要將其分為4類。

1.1 基于DNA-DNA雜交的分子標(biāo)記與云杉天然群體的遺傳研究

1.1.1 RFLP標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

RFLP(restriction fragment length polymorphism，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)是第一個(gè)被應(yīng)用于遺傳研究的 DNA分子標(biāo)記，1974年由 Grozdicker創(chuàng)立。RFLP是一種共顯性遺傳標(biāo)記，首先利用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA消化成不同分子量的同源片段，而后經(jīng)電泳分離再轉(zhuǎn)移到濾膜上，然后進(jìn)行southern雜交，最后通過(guò)放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)限制性酶切片段多態(tài)性。Dering和Lewandowski［7］為了確定冰河后期挪威云杉從避難所遷出形成的接合區(qū)域，利用PCR-RFLP標(biāo)記分析了58個(gè)挪威云杉群體1 353個(gè)個(gè)體的線粒體基因nad1 b/c多態(tài)性，檢測(cè)到波蘭境內(nèi)的挪威云杉有兩種DNA變異型，即“南部單體型”和“北部單體型”。研究發(fā)現(xiàn)這些單體型的地理分布與特有的挪威云杉分布范圍和避難所起源相符。“北方型”主要分布在挪威云杉分布區(qū)的北部，“南方型”主要分布在挪威云杉分布區(qū)的南部。兩種單體型同時(shí)出現(xiàn)在無(wú)云杉區(qū)域(根據(jù)花粉數(shù)據(jù)推測(cè)，在挪威云杉天然分布區(qū)內(nèi)以中歐為界分成南北兩個(gè)區(qū)域，在中歐的斷裂處形成南部與北部的重疊分布區(qū)，也叫無(wú)云杉區(qū))，無(wú)云杉區(qū)域內(nèi)，以標(biāo)記為“南方單體型”的群體出現(xiàn)的頻率較高。結(jié)合化石和花粉數(shù)據(jù)認(rèn)為，波蘭中部平原的挪威云杉群體分別從阿爾巴千山和俄羅斯遷移至此，而后交匯形成。起源于阿爾巴千山的云杉在重疊區(qū)域分布居多，可能是因?yàn)樵撈鹪幢榷砹_斯起源遷移得更早。

1.1.2 VNTR標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

VNTR(variable number of tandem repeats，數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列)也叫小衛(wèi)星標(biāo)記，是共顯性遺傳標(biāo)記，由幾個(gè)到幾十個(gè)核苷酸序列重復(fù)構(gòu)成，拷貝數(shù)為幾十到幾百不等。VNTR的原理與AFLP的基本相同，但要求VNTR的酶切位點(diǎn)在重復(fù)序列之外，且內(nèi)切酶在基因組的其他部位有較多酶切位點(diǎn)，同時(shí)還需滿足雜交DNA探針序列與微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列相同。盡管小衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)信息量較高，但其在基因組中分布不均勻，因此，不如其他標(biāo)記應(yīng)用范圍廣，在云杉群體多樣性研究中也僅有少量的報(bào)道。Bastien等［8］以自然分布區(qū)內(nèi)的14個(gè)挪威云杉群體92個(gè)個(gè)體為材料，檢測(cè)其mtDNA多態(tài)性，共獲得11條長(zhǎng)度為131-447bp的多態(tài)性序列，這些序列由3個(gè)串聯(lián)基序以不同拷貝數(shù)重復(fù)形成。串聯(lián)重復(fù)數(shù)的差異反映出群體間基因多態(tài)性很高，群體間分化很大，遺傳分化系數(shù)Gst=0.749。

1.2 基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記與云杉天然群體的遺傳研究

1.2.1 RAPD標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA)是由Williams于1990年發(fā)明的一種檢測(cè)核苷酸序列多態(tài)性的方法。RAPD通常用1個(gè)8 bp～10 bp隨機(jī)引物非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后利用PCR技術(shù)從擴(kuò)增的DNA片段上分析多態(tài)性，即反映出不同遺傳材料的多態(tài)性。因這種標(biāo)記技術(shù)要求低，對(duì)于生物學(xué)資料未知的基因組就可檢測(cè)到大量多樣性信息，加之成本低，所以幾乎用于云杉屬的各種遺傳分析。Collignon等［9］在挪威云杉的整個(gè)自然分布區(qū)內(nèi)對(duì)其進(jìn)行RAPD和數(shù)量性狀的地理變異分析。據(jù)此，挪威云杉被劃分成北歐和中歐兩個(gè)地理上的類群，每個(gè)類群內(nèi)的數(shù)量性狀和DNA之間存在著明顯的解偶聯(lián)。然而，將分子方面和數(shù)量性狀方面提供的信息結(jié)合起來(lái)能夠?yàn)榈乩碜儺惸Ｊ教峁┬碌纳钊肓私?發(fā)現(xiàn)在Baltico-Nordic區(qū)域是以緯度梯度為主導(dǎo)的地理變異模式，這與通過(guò)花粉數(shù)據(jù)推斷的云杉以東-西方向遷移為主導(dǎo)的地理變異模式明顯相悖;然而，在中歐地區(qū)，云杉以經(jīng)度梯度為主導(dǎo)的遷移與花粉報(bào)告的結(jié)果一致。該研究對(duì)于通過(guò)數(shù)量性狀和DNA得到的一致和矛盾的結(jié)果，以挪威云杉發(fā)生歷史性事件的形式對(duì)其進(jìn)行了討論。Jeandroz等［10］以法國(guó)境內(nèi)8個(gè)挪威云杉群體(6個(gè)天然群體，1個(gè)種子園群體，1個(gè)栽植群體)為材料應(yīng)用RAPD和mtDNA標(biāo)記對(duì)挪威云杉，進(jìn)行了群體間的變異研究。研究通過(guò)RAPD表型分析確定了法國(guó)境內(nèi)歐洲云杉遺傳資源的3個(gè)群體，它們分別是孚日山脈(天然源群體和栽植群體)群體、北阿爾卑斯山群體或侏羅紀(jì)山脈群體以及南阿爾卑斯山群體。境內(nèi)群體的基因多樣性值差異不大。線粒體標(biāo)記的研究結(jié)果顯示，在DNA MH44位點(diǎn)處存在一個(gè)重要變異，6個(gè)孚日山脈的天然參試群體表現(xiàn)出阿爾卑斯山脈群體特有的特征。孚日山脈的栽植群體表現(xiàn)出兩個(gè)額外的mtDNA類型，這支持了19世紀(jì)后期法國(guó)境內(nèi)的歐洲云杉是從歐洲東部遷移而來(lái)的假說(shuō)。

1.2.2 SCAR標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

SCAR(sequence-characterized amplified region，序列特征化擴(kuò)增區(qū)域)是將所找到的RAPD標(biāo)記進(jìn)行克隆并分析，根據(jù)RAPD兩側(cè)序列設(shè)計(jì)特異引物，再對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增而產(chǎn)生的分子標(biāo)記。SCAR常以擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)反映被檢DNA的差異性，此時(shí)為顯性標(biāo)記;有時(shí)也表現(xiàn)為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的多態(tài)性，此時(shí)為共顯性標(biāo)記。Scotti等［11］在研究挪威云杉上一次冰期后再侵入阿爾卑斯山的遷移路線時(shí)，曾對(duì)沿阿爾卑斯山脈的7個(gè)群體和一個(gè)亞平寧山脈群體的7個(gè)SCAR位點(diǎn)進(jìn)行特征分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)挪威云杉的遺傳變異分布不均勻，群體間遺傳分化程度較高，遺傳分化系數(shù)Fst=0.118。根據(jù)分子方差分析和距離分離模型檢驗(yàn)結(jié)果，在亞平寧山脈存在冰期種源區(qū)的假說(shuō)不成立，認(rèn)為亞平寧山脈群體在地理上處于冰期后再次侵入群體分布區(qū)的邊緣，是由迪納拉山脈群體從東北向西南遷移至此形成的，而鄰海的阿爾卑斯山脈則可能有殘余群體，其挪威云杉群體被南北方向的分界線劃分成兩部分。盡管SCAR標(biāo)記在云杉群體遺傳多樣性研究中的應(yīng)用不如RAPD標(biāo)記廣泛，但其能夠彌補(bǔ)RAPD產(chǎn)生假帶、不穩(wěn)定的不足，在云杉屬樹種的親緣關(guān)系分析中發(fā)揮了一定作用。

1.2.3 AFLP標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性)是RAPD標(biāo)記和RFLP標(biāo)記的組合，根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切片段的不同長(zhǎng)度檢測(cè)基因多態(tài)性，同時(shí)兼有RAPD標(biāo)記的簡(jiǎn)便性和RFLP標(biāo)記的可靠性，被認(rèn)為是一種先進(jìn)的DNA分子標(biāo)記，即第二代分子標(biāo)記。AFLP標(biāo)記被廣泛用于云杉屬樹種的遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位等。XR Wang等［12］以瑞典北部7個(gè)島(有的島發(fā)生過(guò)林火，且島的面積不同)上的挪威云杉群體共117個(gè)個(gè)體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)的研究，利用105個(gè)AFLP多態(tài)性標(biāo)記對(duì)材料分析，獲得96個(gè)特異的基因型，平均基因多樣性P為0.37，群體間遺傳變異高，群體間遺傳分化系數(shù)Fst=0.19。研究認(rèn)為遺傳漂變、奠基者效應(yīng)、群體小、低頻率的有性生殖以及產(chǎn)種量少是導(dǎo)致群體間遺傳變異高的原因。

1.2.4 SSR標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

SSR(Simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù))標(biāo)記又叫微衛(wèi)星DNA，通常由1～6個(gè)核苷酸組成的核心序列串聯(lián)重復(fù)而成，長(zhǎng)度通常不超過(guò)200bp，因其兩側(cè)序列為相對(duì)保守的單拷貝序列，可根據(jù)兩側(cè)序列設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得SSR的核心序列，由于核心序列的串聯(lián)重復(fù)數(shù)不同，所以PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度不同，進(jìn)而揭示SSR的多態(tài)性。SSR因具有共顯性、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，所以是群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建等的理想工具。Hodgetts等［13］開發(fā)了白云杉(Picea glauca)的 SSR標(biāo)記，利用13對(duì)引物擴(kuò)增加拿大西部3個(gè)地區(qū)的白云杉材料，獲得14個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每位點(diǎn)等位基因數(shù)為3～32不等，觀測(cè)雜合度Ho為0.33～0.94不等，說(shuō)明白云杉SSR標(biāo)記具有很高的遺傳多態(tài)性。用相同的引物去擴(kuò)增黑云杉(P.mariana)、紅云杉(P.rubens)、挪威云杉(P.abies)、科羅拉多云杉(P.pungens)、北美云杉(P.sitchensis)和恩氏云杉(P.engelmannii)，大多數(shù)都能擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)，且多態(tài)性較高;用這些引物去擴(kuò)增非云杉屬的針葉樹種，發(fā)現(xiàn)并不是所有的都能得到多態(tài)性產(chǎn)物，說(shuō)明這些標(biāo)記可能僅限于云杉屬樹種擁有。A’Hara和Cottrell［14］以一些無(wú)親緣關(guān)系的北美云杉(Picea sitchensis)和其全同胞家系子代為材料，進(jìn)行基因組微衛(wèi)星分析得到觀測(cè)雜合度Ho為0.38～0.91，每位點(diǎn)等位基因數(shù)A為6～21，平均每位點(diǎn)等位基因數(shù)為12.2，并得出其全同胞家系子代多態(tài)性位點(diǎn)分離比遵守孟德爾遺傳規(guī)律的結(jié)論。Scotti等［15］為了粗略獲得挪威云杉染色體組結(jié)構(gòu)圖譜，以瑞典4個(gè)不同區(qū)域25年生的85個(gè)雜交子代個(gè)體為材料，利用6種(AFLP，SSR，S-SAPs，IRAP，ESTP 和 inter-LTR)不同的分子標(biāo)記建立了模擬測(cè)交遺傳連鎖圖譜。該研究利用3種以上的標(biāo)記分別獲得了27個(gè)母本圖譜的連鎖群和23個(gè)父本圖譜的連鎖群，根據(jù)不同標(biāo)記在兩個(gè)圖譜上的分布特點(diǎn)將二者整合，得到具有13個(gè)連鎖群的雙親圖譜，再以此圖譜檢測(cè)每種標(biāo)記在染色體中出現(xiàn)的頻率，并利用自相關(guān)分析找到彼此關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，確定他們?cè)谌旧w上的分布情況。研究發(fā)現(xiàn)不同序列單元在基因組中分布不均勻，有些標(biāo)記聚集分布，而有些有關(guān)聯(lián)的序列卻隨機(jī)分布，研究還發(fā)現(xiàn)并不是所有的標(biāo)記都在染色體上具有等量的連鎖群，說(shuō)明挪威云杉染色體空間結(jié)構(gòu)不是均質(zhì)的。Bastien［8］應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)為11bp的變異序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)生分析，建立的系統(tǒng)發(fā)育樹很好地展示了群體間親緣演化關(guān)系。Nasri等［16］利用父系遺傳的葉綠體微衛(wèi)星研究地理上嚴(yán)格受限的塞爾維亞云杉地方樹種P.omorika的群體遺傳結(jié)構(gòu)。利用7個(gè)天然群體，每群體14個(gè)個(gè)體擴(kuò)增出9個(gè)cpSSR片段，其中包括5個(gè)多態(tài)性區(qū)域，獲得4個(gè)不同的單體型。平均總單體型多樣性HT=0.395，平均群體內(nèi)多樣性HS=0.279，其單體型變異是目前描述過(guò)的大多數(shù)針葉樹中較低的，并依據(jù)單體型變異將其劃分為南部和北部2個(gè)地理群體。北部群體僅有一種單體型，而南部群體表現(xiàn)為2種～3種單體型。研究認(rèn)為當(dāng)前形成的P.omorika群體遺傳結(jié)構(gòu)是由第四紀(jì)冰期的瓶頸作用和遺傳漂變刻畫的。因此，認(rèn)為P.omorika是遺傳衰退樹種中的一個(gè)小群體。Ballian等［17］以巴爾干半島的13個(gè)群體(其中2個(gè)群體與Nasri選用的一樣)為材料進(jìn)行研究，結(jié)果表明:盡管群體間遺傳分化明顯，遺傳分化系數(shù)Fst=0.261，但未檢測(cè)到遺傳變異的地理分化。群體結(jié)構(gòu)的貝葉斯分析結(jié)果顯示，當(dāng)前的塞爾維亞云杉是其祖先P.omoricoides遺留下的一個(gè)分支。Anderson等［18］對(duì)橫貫北美東北部的24個(gè)白云杉群體的cpDNA進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)單體型是特異的，在阿拉斯加區(qū)域的單體型多樣性相當(dāng)高，顯然白云杉很久以前就在具有極端氣候冰河期的異質(zhì)生境中存在，這一結(jié)果反駁了白云杉在冰河后期由南部的勞倫太德冰蓋向北部遷移的結(jié)論。這些結(jié)果都表明，從化石記錄中推測(cè)的遷移速率太高，白云杉適應(yīng)氣候變化的能力不如之前想象的那樣強(qiáng)。Aizawa等［19］以魚鱗云杉(Picea jezoensis)mtDNA 和 cpDNA為材料，對(duì)日、俄、中、韓共33個(gè)天然群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，描繪了魚鱗云杉在日本周圍海峽交匯處的線粒體單體型地理分布模式(群體間遺傳分化系數(shù)GST=0.901;基因流NST=0.934)。然而，以前的魚鱗云杉群體葉綠體單體型分布模式資料顯示日本周邊海峽處花粉流數(shù)據(jù)與此差異很大(GST=0.233;NST=0.333)。物種的地理隔離成為種子和花粉遷移的障礙，隔離的群體分別獨(dú)立進(jìn)化，在群體交匯處則表現(xiàn)出明顯的遺傳分化。因?yàn)榭辈旒影雿u(位于蘇聯(lián)北部)群體不相連接，所以推測(cè)勘察加半島是魚鱗云杉當(dāng)前分布的北緣。研究發(fā)現(xiàn)，在日本境內(nèi)的北海道島和本州島之間存在魚鱗云杉的地理變異型。就此討論了東北亞云杉的演化歷史，認(rèn)為本州島的群體可能是從亞洲大陸經(jīng)朝鮮半島遷移過(guò)去，北海道群體可能從亞洲大陸經(jīng)庫(kù)頁(yè)島遷移過(guò)去。日本境內(nèi)兩島上的群體具有特有線粒體單體型，可能是因第四紀(jì)冰河后期兩島與亞洲大陸在地理上的隔離所致。

1.2.5 ISSR標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

ISSR(Inter-simple Sequence Repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間)標(biāo)記由Zietkiewicz等［20］于1994年開發(fā)，是一種用于檢測(cè)SSR區(qū)間序列差異的分子標(biāo)記技術(shù)。與SSR標(biāo)記相比，ISSR標(biāo)記不需要已知微衛(wèi)星兩側(cè)序列去設(shè)計(jì)引物，就可擴(kuò)增出目的片段，穩(wěn)定性好，且能比RFLP、RAPD和SSR標(biāo)記反映出更多的多態(tài)性信息，在云杉屬群體遺傳多樣性分析中應(yīng)用得較好。Sylwia Dobrzeniecka等［21］利用 ISSR 標(biāo)記對(duì)不同重金屬污染程度的高地和洼地上黑云杉群體進(jìn)行遺傳分析。多態(tài)位點(diǎn)百分率P為65%～90%不等，平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為75%;平均每位點(diǎn)等位基因觀測(cè)數(shù)Na為1.650～1.900，平均有效等位基因數(shù)Ne為1.168～1.632;群體內(nèi)遺傳多樣性h為0.264～0.359不等，平均群體內(nèi)遺傳多樣性為0.310;香濃多樣性指數(shù)I為0.381～0.524，平均值為0.449;群體遺傳距離為0.171～0.351。研究表明，黑云杉群體具有較高的總遺傳變異，但群體間的遺傳變異很低，該研究認(rèn)為群體內(nèi)的遺傳變異很高。該結(jié)論與 Perry和 Bousquet［22］的研究相符。而 Rajora和Pluhar［23］在馬尼托巴省的的東部和北部區(qū)域同樣對(duì)黑云杉天然群體的多樣性進(jìn)行分析，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)群體間存在顯著變異，就此認(rèn)為黑云杉群體間的遺傳多樣性不受地理因素的影響。ISSR可與其他標(biāo)記聯(lián)合用于云杉屬樹種的鑒定。K.K.Nkongolo等［9，10］應(yīng)用 RAPD、ISSR 分子標(biāo)記鑒定了紅云杉、白云杉、黑云杉和恩氏云杉。該研究用ISSR的827號(hào)引物分別擴(kuò)增出450 bp的恩氏云杉特異性片段和770 bp的白云杉特異性片段;用ISSR的841號(hào)引物分別擴(kuò)增出230 bp的白云杉特異性片段和470 bp的黑云杉特異性片段;同樣根據(jù)RAPD標(biāo)記獲得的紅云杉和黑云杉特異性片段將4種云杉鑒別出來(lái)。幼齡時(shí)期的黑云杉在形態(tài)上與白云杉和紅云杉相似，利用分子標(biāo)記分析可將黑云杉從紅云杉和白云杉中鑒別出來(lái)。研究采用ISSR標(biāo)記和SCAR標(biāo)記進(jìn)行分析，認(rèn)為ISSR分析中270 bp片段是白云杉的特征性標(biāo)記，470bp片段為黑云杉的特征性標(biāo)記，SCAR分析中792 bp片段為紅云杉的特征性標(biāo)記，從而，根據(jù) ISSR和 SCAR分析將黑云杉篩選出來(lái)［21］。

1.3 基于mRNA的分子標(biāo)記與云杉天然群體的遺傳研究

1.3.1 EST標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

EST(Expressed sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽)是長(zhǎng)為150 bp～500 bp的基因表達(dá)序列片段。EST標(biāo)記是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并克隆到載體構(gòu)建成cDNA文庫(kù)，再大規(guī)模隨機(jī)挑選cDNA克隆，對(duì)其5'端或3'端進(jìn)行一步法測(cè)序，將所獲序列與基因數(shù)據(jù)庫(kù)已知序列比較，從而獲知生物體生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異、衰老死亡等一系列生命過(guò)程。EST被看作是獲得重要基因序列的快捷途徑，近年來(lái)，開發(fā)出一系列適用于植物研究的EST標(biāo)記，如ESTSSR、EST-RFLP、EST-AFLP和 EST-SNP等。這些標(biāo)記在云杉屬植物的遺傳研究中得到了高效的應(yīng)用。EST-SSR分子標(biāo)記是基于表達(dá)序列標(biāo)簽開發(fā)微衛(wèi)星的一種新型分子標(biāo)記。由于云杉的基因組比較大，重復(fù)的DNA序列較多，經(jīng)常產(chǎn)生復(fù)雜的多位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物，使 SSR標(biāo)記在云杉的應(yīng)用中受到限制，而EST-SSRs標(biāo)記在這一點(diǎn)比SSR標(biāo)記具有優(yōu)越性。EST-SSR與基因組SSR相比，具有可在植物物種之間轉(zhuǎn)移的優(yōu)點(diǎn)。目前，EST-SSR被廣泛應(yīng)用于植物基因組學(xué)方面的研究，如遺傳圖譜構(gòu)建、比較作圖、遺傳多樣性評(píng)價(jià)、種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化研究等［24-29］。Silvia Fluch 等［30］通過(guò)14 022個(gè)挪威云杉EST序列建立SSR標(biāo)記并對(duì)其進(jìn)行特征分析，發(fā)現(xiàn)三核苷酸重復(fù)基序在數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)最多，五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基序次之;用特異性引物對(duì)擴(kuò)增60個(gè)位點(diǎn)，檢測(cè)到測(cè)試群體(16個(gè)個(gè)體)和篩選群體(96個(gè)個(gè)體)中有27個(gè)位點(diǎn)是多態(tài)的。每位點(diǎn)等位基因數(shù)A為2～17個(gè)，觀測(cè)雜合度Ho為0.075～0.99。該研究檢測(cè)到篩選群體中具有很高的遺傳變異，因此認(rèn)為EST-SSR標(biāo)記適用于挪威云杉群體功能基因的變異分析。Yanik Bérubé等［31］曾對(duì)云杉的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了EST-SSRs特征描述，根據(jù)白云杉，恩氏云杉及北美云杉的數(shù)據(jù)分析獲得629個(gè)云杉的特異標(biāo)記。A'Hara和 Cottrell［14］將利用北美云杉gSSR檢測(cè)到的遺傳參數(shù)與在云杉EST文庫(kù)中利用微衛(wèi)星標(biāo)記獲得的遺傳參數(shù)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，gSSR檢測(cè)到的每位點(diǎn)等位基因數(shù)高于他們之前通過(guò) EST-SSR 檢測(cè)［32］到的結(jié)果。Rungis等［33］的研究也得出了相同的結(jié)論。

1.3.2 STS標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

STS(Sequence-tagged Site，序列標(biāo)記位點(diǎn))是在基因組中染色體特定位置上唯一出現(xiàn)的一段已知序列，可以作為界定基因組中染色體片段位置的位標(biāo)［34］。STS標(biāo)記兼具RAPD標(biāo)記的簡(jiǎn)便性和 SSR標(biāo)記的特異性，在云杉群體遺傳分析中得到了應(yīng)用。Bennuah等［35］對(duì)英國(guó)西北部哥倫比亞北美云杉和白云杉基因漸滲區(qū)的16個(gè)區(qū)域57個(gè)家系種子和幼苗的684個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳分析，檢測(cè)其STS等位基因頻率，平均STS雜合指數(shù)為0.46～0.95。研究表明群體間遺傳分化顯著，且群體雜合指數(shù)從沿海向陸地逐漸降低，表現(xiàn)出地理上的變異。雜合指數(shù)的多重回歸分析顯示地理間距主導(dǎo)群體間遺傳分化。Perry和 Bousquet［22］應(yīng)用12個(gè)STS標(biāo)記比較黑云杉群體遺傳多樣性和交配系統(tǒng)在火燒前、后的差異，結(jié)果表明3個(gè)原跡地群體和4個(gè)火燒跡地群體的遺傳雜合度、等位基因數(shù)量、固定指數(shù)都分別相近，群體間遺傳分化不顯著。交配系統(tǒng)指數(shù)在火燒前后也無(wú)顯著變化，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交種。因此認(rèn)為跡地上黑云杉并沒(méi)有因林火的影響降低遺傳多樣性，交配系統(tǒng)也比較穩(wěn)定。Gapare等［36］對(duì)北美云杉8個(gè)群體的遺傳多樣性進(jìn)行研究。根據(jù)其地理分布特點(diǎn)分為核心群體和邊緣群體，對(duì)北美云杉群體進(jìn)行STS分析，結(jié)果表明，核心群體的平均期望雜合度與邊緣群體的極為相似，分別為0.58和0.56;但二者近交系數(shù)相差很多，分別為0.03和0.17;核心群體和邊緣群體的基因流分別為9.0和3.5。8個(gè)群體中，75%以上的等位基因?yàn)槌Ｒ姷膹V域基因，只有一個(gè)為稀有的局域基因，僅分布于一個(gè)不與其他群體相連的核心群體和兩個(gè)不相連的邊緣群體。研究證明，在不相連的外圍群體內(nèi)比相連的核心群體內(nèi)發(fā)生過(guò)的瓶頸作用強(qiáng)烈。因此，建議優(yōu)先對(duì)不相連的邊緣群體進(jìn)行原地保存或擴(kuò)大樣本進(jìn)行異地保存，可將稀有基因保存下來(lái)。Gapare［37］在之前的北美云杉群體空間遺傳結(jié)構(gòu)研究中，曾對(duì)8個(gè)核心群體和邊緣群體每群體200個(gè)個(gè)體進(jìn)行空間作圖和基于cDNA的STS分子標(biāo)記分析。對(duì)一定間距內(nèi)個(gè)體間的平均共祖系數(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示:在核心群體中，距離50 m的個(gè)體間等位基因和基因型的分布是隨機(jī)的，共祖值不顯著，而邊緣群體中，相距小于50 m的個(gè)體間有相似的多態(tài)性位點(diǎn)基因型，共祖系數(shù)比核心群體的高0.20;當(dāng)間隔達(dá)到500 m時(shí)，共組系數(shù)還為正值。研究認(rèn)為，核心群體繁殖個(gè)體的密度相對(duì)大，可能導(dǎo)致種子互相覆蓋，制約了空間遺傳結(jié)構(gòu)的發(fā)展，而邊緣群體中繁殖個(gè)體密度相對(duì)較小，由于子代在母樹很近的地方繁殖，后來(lái)又發(fā)生近親繁殖，很多群體在更新世后期的樹種擴(kuò)張區(qū)域再繁殖，所以等位基因和基因型的分布更具結(jié)構(gòu)性。在制定基因保存策略時(shí)，可能需要對(duì)更多的邊緣群體種質(zhì)進(jìn)行原地保存。研究中有關(guān)空間遺傳結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)可為育種策略的制定和種子資源收集調(diào)查提供依據(jù)。

1.3.3 RT-PCR標(biāo)記在云杉天然群體遺傳研究中的應(yīng)用

RT-PCR(reverse transcription-PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR)是將一條RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的DNA，再以互補(bǔ)的DNA為模板通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。該標(biāo)記的實(shí)用性在于可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。Holliday等［38］對(duì)具有21 840個(gè)特異元件的3個(gè)北美云杉群體cDNA微陣列進(jìn)行群體內(nèi)和群體間秋季基因表達(dá)監(jiān)控。利用該標(biāo)記可以檢測(cè)云杉微陣列芯片數(shù)據(jù)，對(duì)其基因表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，然后通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證候選基因的微陣列芯片數(shù)據(jù)。研究表明，脫水蛋白、與發(fā)病機(jī)制相關(guān)或防凍相關(guān)的基因，碳水化合物和脂代謝基因以及信號(hào)轉(zhuǎn)到和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因數(shù)量在秋季有所增加。群體間微陣列芯片的早秋和晚秋雜交結(jié)果揭示了秋季轉(zhuǎn)錄體的基本變異，認(rèn)為一些時(shí)間點(diǎn)上的雜交還能反映出對(duì)環(huán)境的局部適應(yīng)，為研究北美云杉耐冷機(jī)制提供備了資料。

1.4 基于單核苷酸多態(tài)性的分子標(biāo)記與云杉天然群體的遺傳研究

SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)標(biāo)記是個(gè)體間發(fā)生的最普遍的遺傳變異形式，在基因組中分布廣泛，比SSR標(biāo)記密度還要大，平均每1 000個(gè)堿基對(duì)中就會(huì)有一個(gè)堿基發(fā)生變異［39］。加之其遺傳穩(wěn)定性很高，具有易實(shí)現(xiàn)分析和自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，已成為繼RFLP和SSR標(biāo)記之后的第三代DNA分子標(biāo)記，滲透到了云杉屬的遺傳多樣性分析和聯(lián)合作圖等方面的研究。Namroud等［40］對(duì)6個(gè)白云杉天然群體進(jìn)行SNP分析，從345個(gè)表達(dá)基因中檢測(cè)到534個(gè)SNPs，平均期望雜合度He為0.270，遺傳分化系數(shù)Gst為0.006。研究認(rèn)為是自然選擇導(dǎo)致白云杉發(fā)生了基因分化。Holliday等［41］以14個(gè)北美云杉群體410個(gè)個(gè)體為材料，檢測(cè)與發(fā)芽調(diào)控和秋季耐寒有關(guān)的基因多態(tài)性并進(jìn)行關(guān)聯(lián)作圖，從200多個(gè)表達(dá)基因中檢測(cè)到768個(gè)SNPs。Q聚類和R聚類后，分析28個(gè)候選基因的關(guān)聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)這些候選基因與耐寒表型變異和發(fā)芽調(diào)控表型變異相關(guān)程度分別為28%和34%;推測(cè)存在5個(gè)與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)聯(lián)的重要基因。研究還發(fā)現(xiàn)，很多與表型關(guān)聯(lián)的SNP至少與一種氣候變化相關(guān)。

2 不同DNA標(biāo)記檢測(cè)云杉屬樹種所獲遺傳參數(shù)的比較與分析

?

在評(píng)價(jià)群體遺傳多樣性水平時(shí)，通常涉及到5個(gè)遺傳參數(shù):平均多態(tài)位點(diǎn)百分率(P)、平均期望雜合度(He)、平均Shannon指數(shù)(I)、Nei's遺傳分化值(Gst)和基于AMOVA分析的遺傳分化值(Фst)。其中，Gst和Фst為分化指數(shù)Fst的近似值。20世紀(jì)80年代，Ayala［42］研究組對(duì)主要?jiǎng)又参锏倪z傳多樣性研究進(jìn)行了總結(jié)，認(rèn)為P和He是衡量遺傳多樣性水平的重要參數(shù)。隨后，Hamrick［43］研究組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果支持了Ayala等人的報(bào)道。而Qian等［44］認(rèn)為參數(shù)He和I在遺傳多樣性的評(píng)估上比P更加有效。近年來(lái)，較多遺傳多樣性研究都借助于分子標(biāo)記的手段，多樣性的分析和評(píng)估主要參照Hamrick研究組的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。通過(guò)對(duì)利用不同標(biāo)記所獲云杉的遺傳參數(shù)比較分析，具體見表1，認(rèn)為云杉天然群體遺傳變異豐富，對(duì)環(huán)境變化適應(yīng)能力強(qiáng)，幾乎所有研究表明，群體間存在遺傳分化，但遺傳分化系數(shù)并不高。對(duì)相同云杉屬樹種的遺傳多樣性及遺傳分化分析時(shí)，由于參試群體數(shù)和個(gè)體數(shù)不同，加之采用的DNA標(biāo)記類型不同，得出的結(jié)論不盡相同。

因?yàn)椴煌愋偷姆肿訕?biāo)記探測(cè)范圍不同，檢測(cè)多態(tài)性的程度不同，所以，分析相同材料所獲遺傳參數(shù)值表現(xiàn)出差異，甚至得出相反的結(jié)論。Namroud等［48］在掃描白云杉單核苷酸多態(tài)性基因組的研究中對(duì)幾種不同的分子標(biāo)記進(jìn)行了比較，該研究通過(guò)SNP掃描得到的期望雜合度均低于通過(guò)等位酶、RAPD、AFLP、SSR和 ESTP得到的雜合度，原因是SNP檢測(cè)雙等位基因，而且等位基因突變率很低，加上植物編碼區(qū)域本來(lái)就比非編碼區(qū)域的核苷酸多態(tài)性低，所以得到的多態(tài)位點(diǎn)百分率低，而期望雜合度是通過(guò)多態(tài)位點(diǎn)百分率計(jì)算而得，所以采用SNP獲得的期望雜合度比采用其他幾種檢測(cè)手段檢測(cè)到的遺傳多樣性參數(shù)值低。Jeandroz等［49］對(duì)6個(gè)挪威云杉天然群體的同一套材料，分別應(yīng)用RAPD和mtDNA標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，RAPD的分子方差分析結(jié)果顯示6個(gè)群體差異顯著，而用mtDNA檢測(cè)的分析結(jié)果顯示群體間差異不顯著，與RAPD分析結(jié)果相悖。對(duì)此，作者把兩種標(biāo)記分析結(jié)果產(chǎn)生的矛盾歸結(jié)為兩種標(biāo)記的性質(zhì)差異，即RAPD檢測(cè)雙親遺傳的核DNA，而mtDNA檢測(cè)單親遺傳的線粒體DNA。Dumolin-Lapègue 等［50］在該方面提出自己的看法，認(rèn)為RAPD標(biāo)記主要從總體上揭示物種的遺傳多樣性，而母系遺傳的線粒體DNA標(biāo)記更適于描述群體變異和演化路徑。

Scotti等［51］應(yīng)用 mtVNTRs和 cpSSRs標(biāo)記對(duì)小范圍內(nèi)的亞高山挪威云杉群體空間結(jié)構(gòu)和風(fēng)媒(花粉/種子)更新過(guò)程進(jìn)行研究，該研究所用的材料根據(jù)林木胸徑大小分為兩類，即胸徑不小于10 cm的成熟林和胸徑小于10 cm的幼齡林，通過(guò)cpSSRs標(biāo)記檢測(cè)到的單體型多樣性(以單體型計(jì)數(shù)形式表示，nA=42)高于通過(guò)mtVNTRs標(biāo)記檢測(cè)到的單體型多樣性(nA=8)，說(shuō)明葉綠體標(biāo)記比線粒體標(biāo)記檢測(cè)的遺傳多樣性高。這與之前Nei［52］用相同材料所得結(jié)論一致。Nei的研究是應(yīng)用兩種標(biāo)記對(duì)成熟林和幼齡林群體分別單獨(dú)檢測(cè)遺傳多樣性，并將成熟林和幼齡林作為一個(gè)整體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明cpSSRs檢測(cè)到的遺傳多樣性0.736高于mtVNTRs檢測(cè)到的遺傳多樣性0.478。Scotti將這一現(xiàn)象歸因于3點(diǎn):(i)兩種基因組位點(diǎn)的等位基因突變能力存在差異(ii)線粒體和葉綠體基因的遺傳屬性不同。對(duì)于云杉而言，線粒體基因?yàn)槟赶颠z傳，靠種子傳播，具有有限的基因流;葉綠體基因?yàn)楦赶颠z傳，靠種子和花粉傳播，具有廣泛的基因流，因此，用后者檢測(cè)的遺傳多樣性相對(duì)較高。(iii)用于比較的兩個(gè)基因組的標(biāo)記數(shù)量不同(4個(gè)葉綠體標(biāo)記和2個(gè)線粒體標(biāo)記)。

3 DNA標(biāo)記在云杉種質(zhì)資源保存、遺傳改良方面的應(yīng)用前景

在林木育種工作中，對(duì)種質(zhì)資源的保存通常是對(duì)遺傳多樣性資源的保存，即對(duì)基因資源的保存。因此，對(duì)于云杉而言，通過(guò)DNA分子標(biāo)記研究其天然群體的遺傳結(jié)構(gòu)，所獲數(shù)據(jù)可為育種策略的異地保存提供指導(dǎo)。根據(jù)現(xiàn)有資料顯示，在云杉種質(zhì)資源保存研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外育種專家均主張重視核心種質(zhì)的保存，以盡可能少的樣本盡可能多的保存其遺傳多樣性，提高種質(zhì)資源的保存效率。

種質(zhì)資源的收集與保存是進(jìn)行遺傳改良的遺傳基礎(chǔ)。云杉屬樹種早期的遺傳改良程序通常是對(duì)種和種源進(jìn)行聯(lián)合選擇，了解不同云杉異地適應(yīng)性和生產(chǎn)力，再在種源研究基礎(chǔ)上進(jìn)行種子區(qū)劃，為各造林區(qū)提供最適種源。在優(yōu)良種源區(qū)內(nèi)，還可以進(jìn)一步選擇優(yōu)良林分，將其改建成母樹林，或通過(guò)表型選優(yōu)，營(yíng)建實(shí)生和無(wú)性系初級(jí)種子園對(duì)優(yōu)良種源進(jìn)行利用。盡管采用上述方法可達(dá)到遺傳改良目的，但選育周期很長(zhǎng)，而通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇育種不僅可以克服上述缺點(diǎn)，還可以同時(shí)選擇多個(gè)性狀，是未來(lái)云杉遺傳育種工作中的一個(gè)發(fā)展方向。綜上，DNA分子標(biāo)記在云杉屬樹種的種質(zhì)資源保存與利用方面具有廣闊的前景。

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