楊文超 劉 賽 吳珍紅 繆曉青

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院, 蜂產(chǎn)品加工與應(yīng)用教育部工程研究中心，福州 350002）

蜂糧也稱蜂巢花粉、蜂面包，是雄蜂和工蜂的主要食料和營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，蜂糧是一個(gè)復(fù)雜的微生物系統(tǒng)，具有寶貴的微生物資源[1，2]。優(yōu)良菌株是發(fā)酵制品得到良好的風(fēng)味、質(zhì)地以及產(chǎn)品穩(wěn)定性的基礎(chǔ)，是保證產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵[3]。乳酸菌不僅可以改善食品風(fēng)味，提高食品保藏性和附加值，還有很多特殊的醫(yī)療保健功能[4-7]。從蜂糧中篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵性能的乳酸菌菌株應(yīng)用在蜂花粉的發(fā)酵中，對(duì)油菜蜂花粉的深加工開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

MRS液體培養(yǎng)基（1000ml）：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，K2HPO4·7H2O 2.0g，醋酸鈉·3H2O 5.0g，檸檬酸三銨 2.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐溫801.0ml，pH6.2，115 ℃滅菌15～20 min；MRS培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁100ml，瓊脂1.5g，pH=7.0；紅曲霉種子培養(yǎng)基（100ml）：5g玉米粉加適量水，于60℃水浴4 h后用8 層紗布過(guò)濾，去除殘?jiān)玫接衩诐{，加入0.2gNaNO3，0.5g KH2PO4，0.1g MgSO4·7H2O，補(bǔ)足蒸餾水；pH自然，121℃滅菌30min；紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉10%，NaNO30.5%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH自然；配置方法詳見紅曲霉種子液。

蜂糧源乳酸菌的選定：經(jīng)過(guò)分離、純化、初篩、復(fù)篩，從蜂糧樣品中得到3株乳酸菌。根據(jù)API 50 CH鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果，3株菌分別為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌干酪亞種（Lactobacillus casei ssp casei）、德式乳桿菌德氏亞種（Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii）。分別接種到油菜蜂花粉中進(jìn)行單菌發(fā)酵，測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況和產(chǎn)酸情況，確定植物乳桿菌最適宜應(yīng)用于蜂花粉發(fā)酵。

油菜蜂花粉：由福建省神蜂科技開發(fā)有限公司提供；煙色紅曲霉：購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；胃蛋白酶：天津市諾奧科技發(fā)展有限公司。

電熱恒溫生化培養(yǎng)箱 SPX-250B-Z（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），電熱恒溫水浴鍋 DK-98-1（天津泰斯特儀器制造有限公司），人工凈化操作臺(tái) SWCJ -1D（蘇州凈化設(shè)備有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器 YXQ-LS-75SП（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），恒溫?fù)u床 HZ250L（武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

乳酸菌：從MRS斜面上挑取2～3環(huán)菌株，接入裝有10ml MRS液體培養(yǎng)基的試管中，36℃靜止培養(yǎng)12h，再以10%接入量接入裝有100ml MRS液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，36℃增菌培養(yǎng)12h。

紅曲霉：用無(wú)菌水洗下麥芽汁斜面培養(yǎng)基菌種，并刮下表面菌絲，接種到裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)2d。

1.2.2 紅曲霉發(fā)酵液制備

將培養(yǎng)好的種子液以10%接種量接入到裝有100ml發(fā)酵液培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)7d。

1.2.3 接種方式確定

（1）植物乳桿菌單菌發(fā)酵；（2）將乳酸菌與紅曲霉種子液同時(shí)接入到蜂花粉中發(fā)酵；（3）先將紅曲霉種子液接種到紅曲霉發(fā)酵液中搖瓶培養(yǎng)，將乳酸菌種子液接入到蜂花粉中，同時(shí)添加制備好的紅曲霉發(fā)酵液。以乳酸菌活菌數(shù)和蜂花粉pH值為參考指標(biāo)，比較發(fā)酵效果。

1.2.4 蜂花粉發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定乳酸菌接種量（%）、紅曲霉發(fā)酵液添加量（%）、加水量（%）、發(fā)酵溫度（℃）設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，以乳酸菌活菌數(shù)和感官評(píng)分為指標(biāo)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 蜂花粉乳酸菌計(jì)數(shù)

稱取5.0g發(fā)酵后的蜂花粉，十倍稀釋法制得適宜稀釋度的樣品稀釋液。選擇2～3個(gè)適宜稀釋度，分別吸取1 ml，傾注法接種到MRS培養(yǎng)基，36 ℃厭氧培養(yǎng)48h（每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平板）。選取菌落總數(shù)在30CFU-300CFU之間的平板計(jì)數(shù)，取平均值[8]。

1.2.6 感官評(píng)定

參考“0-4評(píng)判法”[9]，請(qǐng)10名從事食品研究的工作者對(duì)各因素兩兩進(jìn)行重要性比較，確定發(fā)酵蜂花粉感官評(píng)價(jià)時(shí)各因素的權(quán)重：A=[0.34，0.27，0.39]

以發(fā)酵蜂花粉的顏色、香氣和滋味三個(gè)因素為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)滿分為5分。請(qǐng)10名食品感官質(zhì)量考評(píng)員進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

表1 發(fā)酵蜂花粉感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

用正交試驗(yàn)確定的最佳條件進(jìn)行蜂花粉發(fā)酵，測(cè)定所的結(jié)果，比較其與試驗(yàn)組的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種方式的確定

從表2中可知，同時(shí)發(fā)酵時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，分析原因可能是紅曲霉生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，其生長(zhǎng)消耗蜂花粉中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，乳酸菌不能進(jìn)一步獲取足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而死亡；也有關(guān)于紅曲霉與乳酸菌之間存在相互抑制作用的報(bào)道[10]。同時(shí)，從表2中可以看出，添加紅曲霉發(fā)酵液對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，原因可能是紅曲霉發(fā)酵液的中含有蛋白酶、糖化酶等，能夠分解蜂花粉中的大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而為乳酸菌生長(zhǎng)代謝提供能量來(lái)源。綜合比較可知，最佳接種方式為先將紅曲霉種子液接種到紅曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，將制備好的紅曲霉發(fā)酵液添加到蜂花粉中，接種乳酸菌種子液進(jìn)行發(fā)酵。

2.2 乳酸菌接種量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

表2 不同接種方式的乳酸菌活菌數(shù)和蜂花粉pH值

表3 乳酸菌接種量對(duì)產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

當(dāng)乳酸菌接種量小于10%時(shí)，乳酸菌體數(shù)量較少，蜂花粉發(fā)酵不明顯，香氣和滋味都不理想，乳酸菌活菌數(shù)也較少；接種量達(dá)到10%時(shí)，蜂花粉發(fā)酵較充分，乳酸菌活菌數(shù)也較高，從節(jié)約成本的角度出發(fā)，確定乳酸菌接種量的最佳值為10%。

2.3 紅曲霉發(fā)酵液添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

添加量為5%時(shí)，蜂花粉中乳酸菌活菌數(shù)低，感官也較差，這可能是因?yàn)槊割愇镔|(zhì)不足，乳酸菌發(fā)酵受到限制。當(dāng)添加量大于15%時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)較高，但產(chǎn)品感官較差，原因可能有：1）紅曲霉發(fā)酵液顏色較深，添加量過(guò)多會(huì)影響產(chǎn)品色澤；3）紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)生醬香氣；2）乳酸菌在酶類物質(zhì)的幫助下，在蜂花粉中的存活時(shí)間延長(zhǎng)，從而產(chǎn)酸多，使產(chǎn)品過(guò)酸。綜合以上原因，選擇10%為紅曲霉發(fā)酵液最佳添加量。

2.4 加水量對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

由表5可知，隨著加水量的增加，蜂花粉中乳酸菌活菌數(shù)增加，但加水量大于20%后，蜂花粉香氣較弱。當(dāng)加水量為20%時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)高，感官特性也好，故選擇最佳加水量為20%。

表4 紅曲霉發(fā)酵液對(duì)產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

表5 加水量對(duì)產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響

在一定范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，乳酸菌活菌數(shù)增加，36℃時(shí)達(dá)到最高峰。從感官角度考慮，溫度過(guò)低時(shí)發(fā)酵不充分，蜂花粉還帶有苦味，而過(guò)高時(shí)產(chǎn)品顏色較深，滋味也不佳。當(dāng)發(fā)酵溫度為33℃時(shí)乳酸菌活菌數(shù)較高，感官特性好，因此選其為發(fā)酵最佳溫度。

2.6 發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。

從表中的極差分析可以看出，對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響由大到小的順序?yàn)槿樗峋罹鷶?shù)＞紅曲霉發(fā)酵液添加量＞加水量＞發(fā)酵溫度最優(yōu)水平為A3B3C3D2。而影響產(chǎn)品感官分?jǐn)?shù)的因素主次順序?yàn)槿樗峋罹鷶?shù)＞紅曲霉發(fā)酵液接種量＞發(fā)酵溫度＞加水量，因素最優(yōu)水平為A3B2C1D2。可見對(duì)于乳酸菌活菌數(shù)和感官分?jǐn)?shù)而言，4個(gè)因素的影響程度不一致，最優(yōu)方案也不同。為了進(jìn)一步比較各因素水平的優(yōu)先順序，分別以活菌數(shù)、感官分?jǐn)?shù)極差值的平均值Ki為縱坐標(biāo)，以各因素水平為橫坐標(biāo)做圖（圖1和圖2）。

表6 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)品的活菌數(shù)和感官特征的影響

表7 L9(3)4正交試驗(yàn)結(jié)果

圖1 乳酸菌活菌數(shù)隨各因素水平的變化趨勢(shì)

圖2 感官分?jǐn)?shù)隨各因素水平的變化趨勢(shì)

結(jié)合圖5和6和極差分析，因素A對(duì)于兩個(gè)指標(biāo)都是取A3好；因素B是兩個(gè)指標(biāo)中較重要的因素，對(duì)于乳酸菌活菌數(shù)而言，取B3（13%）最好，但取B3時(shí)感官分?jǐn)?shù)低。因此感官特征優(yōu)先考慮選擇B2。因素C從乳酸菌活菌數(shù)角度出發(fā)，應(yīng)取C3（15%），但對(duì)感官分?jǐn)?shù)而言取C1好。由于因素C3對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響大于對(duì)感官的影響，因此選擇C3。因素D對(duì)于兩個(gè)指標(biāo)都是取D2好。綜合各個(gè)因素，發(fā)酵工藝的最佳組合為A3B2C3D2，即乳酸菌接種量13%，紅曲霉添加量10%，加水量25%，發(fā)酵溫度33℃。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

乳酸菌接種量13%，紅曲霉添加量10%，加水量25%，發(fā)酵溫度33℃ 進(jìn)行油菜蜂花粉的發(fā)酵，產(chǎn)品的乳酸菌活菌數(shù)為2.2×107cfu/g，感官評(píng)分4.24，優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組。

3 結(jié)論

采用從蜂糧中分離得到的植物乳桿菌可以對(duì)蜂花粉進(jìn)行發(fā)酵。通過(guò)以乳酸菌活菌數(shù)和感官評(píng)分為試驗(yàn)指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)得到發(fā)酵工藝的最佳組合為乳酸菌接種量13%，紅曲霉發(fā)酵液添加量10%，加水量25%，發(fā)酵溫度33℃。發(fā)酵后的蜂花粉酸甜適口，且富含益生菌。

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