黃金珠

蘆丁對大鼠腸缺血再灌注損傷的保護作用

黃金珠

目的觀察蘆丁對腸缺血再灌注損傷的保護作用，探討其可能的機制。方法 將40只健康Wistar大鼠隨機分為4組(每組10只)：A組為假手術(shù)對照組，B組為缺血再灌注組，C組為缺血再灌注+維生素C組，D組為缺血再灌注+蘆丁組。所有大鼠均行開腹手術(shù)并分離腸系膜上動脈。A組不夾閉腸系膜上動脈，B組、C組、D組夾閉腸系膜上動脈45 min，再復(fù)灌60 min。C組于復(fù)灌前10 min靜脈給予維生素C注射液180mg/kg，D組于復(fù)灌前10min靜脈給予蘆丁注射液50mg/kg。復(fù)灌60min后由腹主動脈穿刺采血制備血清檢測SOD、MPO、D-乳酸、內(nèi)毒素，處死動物取小腸組織，制備腸組織勻漿檢測SOD、MPO。結(jié)果B組與A組相比，B組大鼠血清及腸組織中SOD含量明顯減少，MPO水平增高，血清中D-乳酸和內(nèi)毒素的水平增高;D組與B組比較，D組中血清及腸組織的SOD含量顯著增加，MPO水平下降，血清中的D-乳酸和內(nèi)毒素水平有所減少，并且，D組血清及腸組織的SOD含量高于C組，MPO的水平低于C組，血清中D-乳酸和內(nèi)毒素的水平比C組低。結(jié)論蘆丁具有保護腸缺血再灌注損傷的作用，其機制可能是降低氧自由基的水平，恢復(fù)SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護了腸道屏障功能，使得細(xì)菌“移位”減少，并抑制炎癥反應(yīng)。

腸缺血再灌注;蘆丁;超氧化物歧化酶;D-乳酸;內(nèi)毒素;髓過氧化物酶

各種原因?qū)е氯毖獣r，組織器官會出現(xiàn)細(xì)胞代謝障礙和結(jié)構(gòu)破壞等損傷，而當(dāng)恢復(fù)血流時，上述損傷反而進(jìn)一步惡化，這種現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)。腸道是缺血再灌注損傷發(fā)生的高危場所，尤其在一些較為嚴(yán)重的臨床疾病如休克、感染、創(chuàng)傷、手術(shù)、心肺功能不全等的發(fā)生發(fā)展中，腸缺血再灌注損傷成為這些疾病惡化的助推器。腸缺血再灌注時不僅損傷腸道本身，還會因為屏障功能的損壞，導(dǎo)致腸內(nèi)大量細(xì)菌和毒素入血，進(jìn)而使網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)產(chǎn)生一系列反應(yīng)，釋放出更多的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，引發(fā)膿毒血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多臟器功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。預(yù)防與阻止上述嚴(yán)重問題的發(fā)生與發(fā)展是當(dāng)今臨床工作中面臨的難點與焦點，因此腸組織成為研究探討缺血再灌注損傷的重要方向之一。

蘆丁(rutin)又名蕓香苷、紫槲皮苷，屬于黃酮類化合物，具有抗自由基活性、抗脂質(zhì)過氧化作用、抑制血小板激活因子(PAF)、抑制低密度脂蛋白的氧化修飾、抑制醛糖還原酶、舒張血管、降低毛細(xì)血管通透性和脆性等藥理活性，已廣泛應(yīng)用于臨床［1］，但目前用于腸缺血再灌注損傷方面的報道較少見。本實驗旨在通過動物模型，觀察蘆丁在大鼠腸缺血再灌注損傷中的作用效果，以探究其可能的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型制作 40只健康Wistar大鼠(不限♀♂)，體重220～280 g，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院提供。所有大鼠均無消化道癥狀，未使用過抗生素及影響腸道菌群的藥物。隨機將大鼠分為4組，每組10只。所有大鼠禁食12 h，飲水自由，稱重后腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉。將大鼠仰臥固定，腹部脫毛并消毒，取上腹正中部位切口進(jìn)腹，暴露出腸系膜上動脈(superiormesenteric artery，SMA)。A組：假手術(shù)對照組，開腹后只分離出腸系膜上動脈;B組：缺血再灌注組，用無創(chuàng)動脈夾夾閉腸系膜上動脈根部造成缺血，45 min后去掉動脈夾，使血液再灌注60 min;C組：缺血再灌注+維生素C組，手術(shù)同B組，在松夾之前10 min經(jīng)股靜脈給予維生素C注射液180 mg/kg;D組：缺血再灌注+蘆丁組，手術(shù)同B組，在松夾之前10 min經(jīng)股靜脈給予蘆丁注射液50 mg/kg。

1.2 標(biāo)本采集 松夾60 min后，由腹主動脈穿刺采血4 m l，靜置30 min，離心(3000r/min)10 min，取上清液，即血清，-70℃保存?zhèn)溆?。采血后處死大鼠，距離盲腸10 cm處取長4 cm的小腸一段，剪開清洗后，精確秤取0.2 g，添加2 ml 4℃生理鹽水，低溫下勻漿30秒，保持4℃離心(4500 r/min)30 min，取上清液，即腸組織勻漿，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標(biāo) 檢測血清和腸組織中超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)，血清 D-乳酸、內(nèi)毒素水平。采用SOD、D-乳酸、內(nèi)毒素、MPO測定試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清及腸組織中SOD含量見表1。

表1 SOD levels in the serum and intestinal tissue(±s)

表1 SOD levels in the serum and intestinal tissue(±s)

注：B組與A組比較，*P＜0.05;C組與B組比較，D組與B組比較，▲P＜0.05;D組與C組比較，△P＜0.05

組別 樣本例數(shù)n 血清SOD(U/ml) 組織SOD(U/mg prot)A 10 69.182±6.455 434.386±15.676 B 10 32.456±6.348* 349.487±22.593*C 10 53.730±5.258▲ 389.362±21.691▲D 10 66.758±5.232▲△ 433.790±27.269▲△

3 討論

腸缺血再灌注損傷發(fā)生機制非常復(fù)雜，但大量氧自由基產(chǎn)生的破壞作用已經(jīng)明確［2］。超氧化物歧化酶(SOD)是內(nèi)源性抗氧自由基物質(zhì)，如果氧自由基生成過多，那么SOD就會被大量消耗掉，我們把SOD活性的變化作為觀察缺血再灌注中氧自由基產(chǎn)生的指標(biāo)。本實驗顯示，B組大鼠血清和組織中的SOD活性明顯低于A組(P＜0.05)，說明在腸缺血再灌注中有大量的氧自由基產(chǎn)生。而C組和D組大鼠血清和組織中SOD活性均高于B組(P＜0.05)，說明維生素C和蘆丁均具有抗氧化的作用，并且蘆丁的抗氧化能力強于維生素C(P＜0.05)。這與前人對蘆丁抗氧自由基的研究結(jié)果相一致［3］。

人體不會產(chǎn)生D-乳酸，它是由消化道內(nèi)的定植細(xì)菌產(chǎn)生，如克雷伯桿菌、大腸桿菌等。病理情況下，如嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克、胰腺炎等，腸道黏膜保護屏障被破壞，D-乳酸就會進(jìn)入循環(huán)血液，并且人體也不能或僅能緩慢把它代謝掉。經(jīng)動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，急性腸道缺血可使D-乳酸含量迅速升高［4］，其水平會隨著缺血時間的延長而增高［5，6］。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，如果腸道革蘭氏陰性細(xì)菌過度生長，就會擴大內(nèi)毒素池，此時若腸道屏障受損，就會使細(xì)菌和內(nèi)毒素溢入血液循環(huán)，即所謂的“移位”現(xiàn)象，進(jìn)一步對全身器官組織造成嚴(yán)重?fù)p害，甚至引起SIRS和MODS。本實驗證實，B組大鼠血清中D-乳酸和內(nèi)毒素水平明顯高于A組(P＜0.05)，說明腸缺血再灌注后腸黏膜屏障嚴(yán)重?fù)p壞，通透性顯著增加，細(xì)菌發(fā)生了“移位”。D組中D-乳酸和內(nèi)毒素水平低于B組和C組(P＜0.05)，說明蘆丁可能抑制了腸道菌群“移位”，阻止損傷的加重。

研究表明抑制中性粒細(xì)胞的激活可以保護小腸缺血再灌注損傷［7］。無論是缺血期還是再灌注期，組織中都存在大量中性粒細(xì)胞聚集，它被激活后會釋放大量氧自由基，尤其在再灌注期氧供充足時，氧自由基的產(chǎn)生呈爆發(fā)式。氧自由基加上各種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，一方面直接造成腸組織細(xì)胞損傷，另外一方面參與介導(dǎo)SIRS和MODS的發(fā)生發(fā)展。中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中有一種能清除氧自由基的酶-髓過氧化物酶(MPO)，每個中性粒細(xì)胞所含的MPO的量是一定的，所以MPO被公認(rèn)為中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，B組比A組腸組織中的MPO增多(P＜0.05)，表明缺血再灌注時有大量中性粒細(xì)胞向腸組織聚集并且活化，D組MPO明顯少于B組和C組(P＜0.05)，說明蘆丁可以抑制中性粒細(xì)胞的聚集，這可能與蘆丁的抗炎作用有關(guān)，武征等人通過大鼠急性胰腺炎模型證實，蘆丁通過抑制NF-κB的活化使靶基因TNF-α、ICAM-1等炎癥性細(xì)胞因子表達(dá)降低，從而抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)［9］。

4 結(jié)論

蘆丁可降低腸缺血再灌注損傷中氧自由基的水平，恢復(fù)SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護腸道屏障功能，改善腸黏膜通透性，使細(xì)菌“移位”減少，抑制炎癥反應(yīng)，起到對腸缺血再灌注損傷的保護作用。

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473061 南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校

2.2 血清中D-乳酸、內(nèi)毒素含量見表2。

表2 D-lactate and Endotoxin levels in the serum(±s)

注：B組與A組比較，C組與A組比較，*P＜0.05;D組與B組比較，▲P＜0.05;D組與C組比較，△P＜0.05

組別 樣本例數(shù)n 血清D-乳酸(mmol/L) 血清內(nèi)毒素(EU/ml)A 10 0.178±0.027 0.168±0.045 B 10 0.398±0.033*0.212±0.023*C 10 0.323±0.029*0.209±0.048*D 10 0.199±0.031▲△0.179±0.019▲△

2.3 血清及腸組織中MPO含量見表3。

表4 MPO levels in the serum and intestinal tissue(±s)

注：B組與A組比較，*P＜0.05;C組與B組比較，▽P＜0.05;D組與B組比較，▲P＜0.05;D組與C組比較，△P＜0.05

組別 樣本例數(shù)n 血清MPO(u/ml) 組織MPO(u/ml prot)A 10 48.16±7.14 0.39±0.12 B 10 128.39±30.452*1.54±0.19*C 10 84.67±7.97▽0.92±0.08▽D 10 59.67±9.81▲△0.54±0.10▲△