李建偉，楊 志，劉曉滿，吳世華*

1寧波天韻農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，寧波315192; 2浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院思源天然藥物與生物毒素研究中心，杭州310058

海蘆筍及其生物鹽中多酚酸和綠原酸的定量分析

李建偉1，楊 志2，劉曉滿2，吳世華2*

1寧波天韻農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，寧波315192;2浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院思源天然藥物與生物毒素研究中心，杭州310058

以綠原酸為對照品，利用紫外分光光度法和高效液相色譜法分別建立了測定海蘆筍中多酚酸和綠原酸含量的方法。紫外分光光度法檢測波長為338 nm;高效液相色譜法采用Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5um)，以甲醇和0.5%冰醋酸水溶液梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)海蘆筍及其生物鹽中含有大量的多酚酸和綠原酸，其中多酚酸含量分別為6.49 g/kg，3.37 g/kg，綠原酸含量分別為0.234 g/kg，0.180 g/kg。同時也表明高效液相色譜法可用于海蘆筍中多酚酸含量的確定。這兩種簡單快捷的定量分析多酚酸和綠原酸的方法，不僅可用于海蘆筍及其生物鹽產(chǎn)品的質(zhì)量控制，而且也為海蘆筍的進一步研究和開發(fā)提供了一定的依據(jù)。

海蘆筍;總酚酸;綠原酸;紫外分光光度法;HPLC-DAD;定量分析

海蘆筍(Salicornia bigelovii Torr.)屬藜科鹽角草屬植物，原產(chǎn)美州鹽沼地［1，2］。一些研究［3-6］表明，海蘆筍富含人體必須的8種氨基酸、維生素、食用纖維及微量元素鈣、鐵、鋅、碘等海洋礦物質(zhì)，也含有高含量的胡蘿卜素、維生素C和天然皂苷等多種活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)人體酸堿平衡，清除血管壁膽固醇，預(yù)防心腦血管疾病等方面具有較好的應(yīng)用前景。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)海蘆筍具有較強的抗氧化活性［7］，含有一定量的黃酮［8］。黃酮是多酚的一種，是植物產(chǎn)生抗氧化效應(yīng)的重要原因之一。人們已從其同屬植物中分離出一些黃酮等酚性物質(zhì)［9-12］，但有關(guān)海蘆筍中的多酚性成分尚未知。最近，我們用液相色譜－電噴霧離子質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)海蘆筍中含有大量的多酚酸類成分，主要是綠原酸等單或雙咖啡?？崴犷惢衔?。本研究擬建立兩種定量分析海蘆筍中多酚酸和綠原酸的方法，為其質(zhì)量控制、進一步研究及開發(fā)提供一定的依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

儀器：UV-2401PC紫外-可見分光光度計;Agi-lent 1100高效液相色譜儀;

試劑：甲醇，0.5%醋酸溶液，綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號110753-200413)。冰醋酸(分析純，杭州華東醫(yī)藥集團)，甲醇(色譜純，美國默克公司)，超純水(18.2 MΩ，杭州萬潔水處理器制備)。新鮮海蘆筍和海蘆筍生物鹽由寧波天韻農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，新鮮海蘆筍經(jīng)裝冷凍干燥后粉碎作為樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC-DAD法分析海蘆筍中多酚酸

色譜條件：色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5um);流動相A：甲醇，B：0.5%醋酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，A從15%增至30%; 15～45 min，A從30%增至45%;45～50 min，A從45%增至100%;然后保持5 min。柱后平衡8 min，再進行下次分析。流速0.8 mL/min，進樣量10 μL柱溫30℃，檢測波長338 nm。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg，用超純水定容至 25 mL。依次倍半稀釋至0.3125 μg/mL，并按上述色譜條件分別進樣分析。以濃度x為橫坐標(biāo)，綠原酸對應(yīng)峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品溶液配制及綠原酸含量測定：每次精確稱取樣品20.0 mg，用超純水超聲溶解并定容至10 mL。在相同的色譜條件下進樣，測定海蘆筍及其生物鹽中綠原酸含量。

1.2.2 紫外分光光度法測定海蘆筍中總酚酸含量

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按1.2.1中溶液制備方法配制濃度在0.3125～80 μg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，超純水做空白對照，用紫外-可見分光光度計于338 nm依次測定其吸光值，以濃度y為橫坐標(biāo)，吸光值x為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制：按上述配制方法，以綠原酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，超純水為溶劑配制成濃度80 μg/mL的溶液，儲存?zhèn)溆谩?/p>

樣品溶液配制及總酚酸含量的測定：同上述HPLC方法配制樣品一樣，每次精確稱取樣品20.0 mg，用超純水超聲溶解并定容至10 mL。取配制好樣品1.5 mL，于紫外-可見分光光度計中測定總酚酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

利用HPLC-DAD法分析海蘆筍中的綠原酸及總酚酸含量，綠原酸的濃度和HPLC峰面積呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，其線性方程為 y=103.62x，R2= 0.9997，其線性范圍：0.3125～80 μg/mL。

分光光度法分析表明綠原酸的濃度與吸光度也呈良好的線性關(guān)系，其線性方程為y=0.0302x+ 0.0004，R2=0.9999，線性范圍：0.3125～80 μg/mL。

2.2 精密度試驗

HPLC-DAD法對同一對照品溶液(10 μg/mL)連續(xù)進樣5次。其相對保留時間穩(wěn)定，各峰相對峰面積的RSD 0.17%，表明儀器精密度符合要求。對同一濃度的溶液(40 μg/mL)在紫外可見分光光度計中重復(fù)測定5次，結(jié)果RSD為0.23%，表明本方法在此條件下精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗

平行制備5份海蘆筍生物鹽樣品，HPLC-DAD法進樣檢測綠原酸含量。其相對保留時間穩(wěn)定，各峰相對峰面積的RSD(3.7%)小于5%，表明試驗方法重復(fù)性良好。按上述溶液配制方法配制5份樣品，在紫外可見光光度計中測定總酚酸。結(jié)果(RSD 3.77%)小于5%，表明試驗方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

HPLC-DAD法對同一樣品在24 h內(nèi)每隔4 h測定綠原酸一次。其結(jié)果相對保留時間穩(wěn)定，各峰相對峰面積的RSD(0.84%)小于5%，表明綠原酸穩(wěn)定性良好。紫外可見分光光度計法在2 h內(nèi)每隔30 min測定一次海蘆筍生物鹽水溶液的吸光值，共測定5次。結(jié)果RSD為2.40%，小于5%。

2.5 回收率試驗

精密稱取同一已知濃度(0.6624 μg/mL)樣品9份，平均分為三組，分別加入濃度為5、2.5和1.25 μg/mL的對照品水溶液，混勻，HPLC-DAD法測定其回收率?；厥章势骄禐?6.7%(n=9)，RSD= 3.5%。同樣，精密稱取同一樣品分成兩組共6份，分別加入相同體積濃度為40 μg/mL和20 μg/mL的對照品水溶液，混勻，于紫外可見分光光度計中測定其吸光度，計算回收率。測得結(jié)果回收率平均值為99.27%(n=6)，RSD 0.94%。

2.6 含量測定

在相同的色譜條件下，測定海蘆筍及其生物鹽中綠原酸含量。結(jié)果測得海蘆筍及其生物鹽中綠原酸含量分別為0.234 g/kg，0.180 g/kg。

2.7 海蘆筍中多酚酸及綠原酸的HPLC分析

由于酚酸及黃酮等具有弱酸性，因此本實驗采用酸性的甲醇-水體系。通過細調(diào)梯度，結(jié)果得到了較好的分離條件。如圖1所示，這種條件能較好地分辨出海蘆筍中的30余種酚性成分，其中9種酚酸含量相對較高。同步的HPLC-DAD表明這些主要的多酚性成分與標(biāo)樣綠原酸(2)具有相似的紫外吸收，即均在338 nm處有較強的紫外吸收，表明這些成分具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，我們選擇338 nm作為定量波長。

圖1 海蘆筍干粉的液相色譜圖Fig.1 The HPLC and Utraviolet Spectrum of Salicornia bigelovii Torr.powder

表1 海蘆筍及其生物鹽中多酚酸的含量Table 1 The content of the total phenolic acids in Salicornia bigelovii Torr.and its biosalt production.

利用建立的HPLC定量方法，海蘆筍及其生物鹽中的綠原酸(2)和其它多酚可以得到準(zhǔn)確或相對的定量。如表1所示，與其生物鹽相比，海蘆筍干粉中除含有綠原酸等單咖啡?？崴犷惢衔锿?，雙咖啡酰奎尼酸類化合物更多，這主要是因為雙咖啡?？崴犷惢衔锼苄员染G原酸等單咖啡?？崴犷惢衔锏纳孕?，當(dāng)用水進行提取時，只有一部分可以溶解，這種原因使得用水提取生產(chǎn)的生物鹽中的主要成分是水溶性強的極性成分。因此，如果要提取海蘆筍中的多酚酸成分，除了水以外，還應(yīng)考慮加入一些極性溶劑，如乙醇等。

而且，根據(jù)338 nm檢測到的峰面積和近似的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以近似地定量海蘆筍中總的多酚酸的含量，數(shù)據(jù)見表1。

2.8 海蘆筍中總酚酸的紫外分光光度法定量分析

除HPLC-DAD方法外，海蘆筍中總酚酸成分的含量進一步用紫外分光光度法證實。如表1所示，海蘆筍和生物鹽中總酚酸含量分別為6.67 g/kg、3.77 g/kg。這一結(jié)果表明，HPLC方法與紫外分光光度法測定的結(jié)果相接近。與HPLC法相比，紫外分光光度法可以較快地分析出海蘆筍中的總酚酸含量，而且操作簡單，便于在工廠應(yīng)用。但是，HPLC方法可以同時地獲得其它所有酚性組分的相對含量，也是一種很有希望的質(zhì)量控制方法。

3 討論

多酚是一類重要的抗氧化物，本研究發(fā)現(xiàn)海蘆筍中含有較高含量的綠原酸等單或雙咖啡?？崴犷惪寡趸镔|(zhì)，而這可能與海蘆筍長期面臨鹽脅迫生境有關(guān)［7，13］。綠原酸被認為是眾多藥材和中成藥的主要有效成分，通常被作為定性甚至定量的指標(biāo)。如綠原酸是金銀花中主要的有效成分，具有顯著的清熱解毒、抗菌消炎以及防腐等作用［14］。據(jù)報道，綠原酸的主要生物活性有：對透明質(zhì)酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用;對自由基的清除及抗脂質(zhì)過氧化作用;抗誘變和抗腫瘤作用;保肝利膽作用;抗菌、抗病毒及解痙等作用。咖啡?；崴峋哂锌寡趸钚浴⒅委熝装Y、抑制微生物和病毒活性、酶抑制作用、保肝活性、抗凝血活性等多種生物活性［15］。在藥效學(xué)上，新發(fā)現(xiàn)的綠原酸具有顯著活性的藥理作用，可為新藥開發(fā)提供新的思路［16］。作為天然的海水蔬菜，海蘆筍因具有這些抗氧化成分而具有更大的優(yōu)勢。而且海蘆筍中還含有高含量的Na、K、Ca、Mg等人體必需元素，作為人體的元素平衡用品具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究建立的HPLC和紫外分光光度法對于海蘆筍及其生物鹽的質(zhì)量控制具有重要意義，可為海蘆筍今后作為一種醫(yī)藥和保健品開發(fā)提供一定的安全依據(jù)。

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Quantitative Analysis of Phenolic Acids and Chlorogenic Acid of Salicornia bigelovii Torr.

LI Jian-wei1，YANG Zhi2，LIU Xiao-man2，WU Shi-hua2*2Tianyun Agriculture Research and Development Ltd.Corp，Ningbo 315192，China;2Research Center of Siyuan Natural Pharmacy and Biotoxicology，Collage of Life Sciences，Zhejiang UniversityHangzhou 310058，China;

Two methods including the ultraviolet spectrophotometry and the HPLC-DAD had been developed to analyze quantitatively the total phenolic acids and chlorogenic acid of Salicornia bigelovii Torr.，and its biosalt production.The ultraviolet spectrophotometry was set at 338 nm and chlorogenic acid was used as the reference substance.HPLC was performed on a Zorbax Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5um)using a mobile phase of methanol and 0.5%acetic acid aqueous solution with a linear gradient.It was found that S.bigelovii contained high contents of phenolic acids and chlorogenic acid，and the contents of the total phenolic acids was 6.49 g/kg and 3.37 g/kg for S.bigelovii and its biosalt production，while the contents of chlorogenic acid was 0.234 g/kg and 0.180 g/kg.It was very efficient for quantitative analysis of the total phenolic acids and chlorogenic acid and could be used for quality control of S.bigelovii and its biosalt production.

Salicornia bigelovii Torr.;polyphenols;chlorogenic acid;HPLC;quantitative analysis

1001-6880(2012)04-0494-04

2010-11-30 接受日期：2011-05-27

寧波市科技計劃項目(2007C10029)

*通訊作者 Tel：86-571-88206287;E-mail：drwushihua@zju.edu.cn

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