劉 濤，李占林，王 宇，田 黎，裴月湖，華會(huì)明

1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110001;2沈陽(yáng)藥科大學(xué)創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計(jì)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110016; 3國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島266061;4青島科技大學(xué)，青島266042

海洋真菌Fusarium sp.次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究

劉 濤1*，李占林2，王 宇2，田 黎3，4，裴月湖2，華會(huì)明2

1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽(yáng)110001;2沈陽(yáng)藥科大學(xué)創(chuàng)新藥物研究與設(shè)計(jì)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110016;3國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島266061;4青島科技大學(xué)，青島266042

采用硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、開(kāi)放ODS柱色譜以及HPLC等方法從海洋真菌Fusarium sp.的菌絲體中分離得到5個(gè)化合物，通過(guò)波譜數(shù)據(jù)及理化性質(zhì)分別鑒定為3β，15β-二羥基-(22E，24R)-麥角甾-5，8(14)，22-三烯-7-酮(1)、3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮(2)、(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇(3)、5α，8α-過(guò)氧-(22E，24R)-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇(4)和丁二酸(5)。其中化合物1和2首次從該屬真菌中分離得到。

海洋真菌;鐮孢霉屬真菌;次級(jí)代謝產(chǎn)物;麥角甾醇

海洋生物總量約占地球生物總量的87%，是一個(gè)巨大的生物資源寶庫(kù)。海洋獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境造就了其生物的生存及代謝方式的特殊性［1］。

美國(guó)國(guó)立腫瘤研究所(NCI)，自1986年起將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向?qū)Ｑ笳婢?、藍(lán)細(xì)菌以及其它各類型海洋微生物的研究。其研究結(jié)果表明，海洋微生物在抗腫瘤藥物方面具有巨大的開(kāi)發(fā)價(jià)值。近些年來(lái)，隨著對(duì)海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物研究的不斷深入，從海洋真菌中發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的抗癌活性物質(zhì)，而且它們往往具有新穎的結(jié)構(gòu)。海洋真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物已經(jīng)成為了一個(gè)熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域。

鐮孢霉屬(Fusarium)又名鐮刀菌屬，為半知菌亞門(Deuteromycotina)，絲孢綱(Hyphomycetes)，瘤座孢目(Tuberculariales)中的一個(gè)屬，是重要的真菌類群。陸生鐮孢霉屬真菌是一種常見(jiàn)的植物病原菌［2］。近年來(lái)，從海洋來(lái)源的鐮孢霉屬真菌中相繼發(fā)現(xiàn)了環(huán)肽、神經(jīng)鞘胺醇苷、蒽醌及甾體衍生物等許多結(jié)構(gòu)獨(dú)特，活性顯著的次生代謝產(chǎn)物，引起了人們的廣泛關(guān)注。為了尋找新的抗癌活性成分，作者對(duì)海洋來(lái)源鐮孢霉屬真菌Fusarium sp.菌絲體的丙酮提取物進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從中分離得到5個(gè)化合物，通過(guò)1D和2D NMR以及文獻(xiàn)對(duì)照等手段鑒定了這些化合物的結(jié)構(gòu)。

1 儀器與材料

Bruker ARX-300和AV-600型核磁共振儀;日本HITACHI公司L 2130型HPLC，檢測(cè)器為HITACHI L 2400型;YMC-Pack ODS-AM:10 mm×250 mm;開(kāi)放ODS柱色譜填料(100 μm，日本YMC公司);Sephadex LH-20為GEhealthcare產(chǎn)品;柱色譜硅膠(200～300目)及薄層色譜硅膠均購(gòu)于青島海洋化工廠。所有試劑為分析純和色譜純。

海洋鐮孢霉屬真菌Fusarium sp.于2007年4月分離自南海潮間帶紅樹(shù)植物正紅樹(shù)(Rhizophora apiculata)根際泥，由國(guó)家海洋局第一海洋研究所，青島科技大學(xué)田黎教授鑒定。菌株編號(hào):HTTM-Z07006，存放于科技部資助的國(guó)家海洋局第一海洋研究所藥用海洋微生物菌種資源庫(kù)。

發(fā)酵培養(yǎng)基及條件:馬鈴薯浸汁200 mL，蛋白胨2 g，酵母粉1 g，葡萄糖17 g，NaCl 15 g，MgCl2· 6H2O 1 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)ePO40.01 g，水1000 mL，24℃，150 rpm，振蕩培養(yǎng)12 d，發(fā)酵量60 L。

2 提取分離

發(fā)酵液60 L，經(jīng)多層紗布過(guò)濾，分離得到濾液和菌絲體。菌絲體(濕重1906.5 g)經(jīng)反復(fù)“冷凍-融化”處理后，用4倍量丙酮超聲提取三次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮得浸膏81.5 g。浸膏經(jīng)硅膠柱色譜，用氯仿-甲醇(100∶0～0∶100)進(jìn)行梯度洗脫，得到282個(gè)流份(500 mL/流份)。第33～55流份合并，經(jīng) Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第6-15亞流份合并，經(jīng)硅膠柱色譜，用石油醚-丙酮(50∶1～7∶2)進(jìn)行梯度洗脫，得到化合物4(6 mg);第51-57流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第17-19亞流份合并，經(jīng)開(kāi)放ODS柱色譜及Sephadex LH-20柱色譜得到化合物1(2 mg);第85～95流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第11～14亞流份合并，經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，所得流份再經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20(甲醇洗脫)，HPLC(體積分?jǐn)?shù)30%的甲醇水溶液為流動(dòng)相，保留時(shí)間為75 min)以及開(kāi)放ODS柱色譜(體積分?jǐn)?shù)為30%～75%的甲醇水溶液梯度洗脫)得到化合物2(2 mg);第96-123流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第12～16亞流份合并，經(jīng)硅膠柱色譜，氯仿-甲醇(9∶1，5∶1)梯度洗脫，得到化合物3(3 mg);第124-135流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，第16～19亞流份合并，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，用氯仿-甲醇(1∶1)進(jìn)行洗脫，得到化合物5(7 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 無(wú)色針狀結(jié)晶(甲醇)，1H NMR(300 MHz，C5D5N)給出δ 1.09(3H，d，J=6.6 Hz)，1.00 (3H，s)，0.95(3H，s)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz)，0.84(3H，d，J=6.8 Hz)六個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)，結(jié)合13C NMR(150 MHz，C5D5N)給出28個(gè)碳信號(hào)，推測(cè)該化合物為麥角甾類。δ 5.30(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz)，5.28(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz)為側(cè)鏈22，23位反式雙鍵相互偶合的特征質(zhì)子信號(hào)。δ 6.04(1H，d，J=1.8 Hz)為一烯氫質(zhì)子信號(hào)，結(jié)合碳譜給出的7個(gè)碳信號(hào)(δ 191.7，171.5，169.6，135.1，132.8，128.7，127.0)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)碳碳雙鍵(其中三個(gè)為季碳)以及一個(gè)羰基，且兩個(gè)雙鍵與羰基形成共軛體系。氫譜給出δ 4.98(1H，br s)，3.88(1H，m)兩個(gè)連氧碳上質(zhì)子信號(hào)，結(jié)合碳譜中δ 70.3，69.6兩個(gè)連氧碳信號(hào)，推測(cè)結(jié)構(gòu)中應(yīng)該有兩個(gè)羥基取代。HMBC進(jìn)一步給出H-15(δH4.98，1H，br s)與C-13(δC45.9)，C-17(δC53.7)，C-8(δC128.7)的遠(yuǎn)程相關(guān); H-18(δH0.95，3H，s)與C-14(δC169.6)的遠(yuǎn)程相關(guān)，可以確定15-OH及△8(14)的取代位置。根據(jù)H-6(δH6.04，1H，d)與 C-10(δC40.1)，C-4(δC42.7)，C-8(δC128.7)存在遠(yuǎn)程相關(guān)以及H-19(δH1.00，3H，s)與C-5(δC171.5)存在遠(yuǎn)程相關(guān)，可確定△5(6)的取代位置。根據(jù)△5(6)，△8(14)四個(gè)雙鍵碳的化學(xué)位移值，推測(cè)結(jié)構(gòu)中存在兩對(duì)α，β-不飽和羰基，因此羰基碳應(yīng)在C-7位。采用CDCl3重新測(cè)試該化合物的1H NMR，H-15化學(xué)位移值為δ 4.70(d，J=5.4 Hz)，15-OH化學(xué)位移值為5.66，與文獻(xiàn)［3］對(duì)照確定15位羥基為β構(gòu)型。根據(jù)以上信息并結(jié)合文獻(xiàn)［3］，確定該化合物結(jié)構(gòu)為3β，15β-二羥基-(22E，24R)-麥角甾-5，8(14)，22-三烯-7-酮［3β，15β-dihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-5，8(14)，22-triene-7-one］。具體 NMR數(shù)據(jù)歸屬如下:1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:6.04(1H，d，J=1.8 Hz， H-6)，5.30(1H，dd，J=15.2，7.9 Hz，H-22)，5.28 (1H，dd，J=15.2，7.9 Hz，H-23)，4.98(1H，br s，H-15)，3.88(1H，m，H-3)，2.82(1H，m，H-4b)，2.69 (1H，m，H-4a)，2.43(1H，m，H-9)，2.18(2H，m，H-16b，20)，2.11(1H，m，H-2b)，2.00(2H，m，H-12b，17)，1.87(1H，m，H-16a)，1.86(1H，m，H-24)，1.78 (1H，m，H-2a)，1.77(1H，m，H-1b)，1.76(2H，m，H-11)，1.45(1H，m，H-25)，1.38(1H，m，H-12a)，1.24 (1H，m，H-1a)，1.09(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，1.00(3H，s，H-19)，0.95(3H，s，H-18)，0.92(3H，d，J=6.8 Hz，H-28)，0.85(3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.84(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)。13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ:191.7(C-7)，171.5(C-5)，169.6(C-14)，135.1(C-22)，132.8(C-23)，128.7(C-8)，127.0(C-6)，70.3(C-15)，69.6(C-3)，53.7(C-17)，47.1(C-9)，45.9(C-13)，43.1(C-24)，42.7(C-4)，40.1(C-10)，38.9(C-20)，37.5(C-16)，35.7(C-12)，35.6 (C-1)，33.3(C-25)，32.0(C-2)，19.4(C-11)，21.8 (C-21)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，19.5(C-18)，18.8(C-19)，17.8(C-28)。

化合物2 白色無(wú)定形粉末，1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:8.62(1H，s，5-OH)，6.28(2H，br s，3-OH and 9-OH)，5.93(1H，d，J=2.1 Hz，H-7)，5.27(1H，dd，J=15.3，7.2 Hz，H-23)，5.17(1H，dd，J=15.3，7.2 Hz，H-22)，4.64(1H，m，H-3)，1.15 (3H，s，H-19)，1.04(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.95 (3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.86(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.85(3H，d，J=6.9 Hz，H-26)，0.63(3H，s，H-18)。13C NMR(75 MHz，C5D5N)δ:199.1(C-6)，164.1(C-8)，135.2(C-22)，132.4(C-23)，120.3 (C-7)，79.8(C-5)，75.0(C-9)，66.8(C-3)，56.1(C-17)，52.0(C-14)，45.3(C-13)，43.1(C-24)，42.2 (C-10)，40.6(C-20)，38.2(C-4)，35.5(C-12)，33.3 (C-25)，31.5(C-2)，29.0(C-11)，28.4(C-16)，26.4(C-1)，22.7(C-15)，21.3(C-21)，20.4(C-19)，20.2(C-27)，19.9(C-26)，17.9(C-28)，12.4(C-18)。以上數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)［4］對(duì)照確定該化合物結(jié)構(gòu)為3β，5α，9α-三羥基-(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-6-酮［3β，5α，9α-trihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one］。

化合物3 無(wú)色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，1H NMR(300 MHz，C5D5N)δ:5.74(1H，m，H-7)，5.25 (1H，dd，J=15.0，6.9 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J= 15.0，6.9 Hz，H-23)，4.83(1H，m，H-6)，4.32(1H，m，H-3)，1.53(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.94(3H，d，J=6.9 Hz，H-28)，0.85 (3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.84(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)，0.65(3H，s，H-18)。13C NMR(75 MHz，C5D5N)δ:141.5(C-8)，136.1(C-22)，132.1(C-23)，120.5(C-7)，76.1(C-5)，74.3(C-6)，67.6(C-3)，56.1(C-17)，55.2(C-14)，43.7(C-9 and C-13)，43.0(C-24)，42.0(C-4)，40.9(C-20)，39.9(C-12)，38.1(C-10)，33.8(C-2)，33.3(C-25)，32.7(C-1)，28.5(C-16)，23.5(C-15)，22.4(C-11)，21.4(C-27)，20.1(C-26)，19.8(C-21)，18.8(C-19)，17.8 (C-28)，12.5(C-18)。以上數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)［5］對(duì)照確定該化合物結(jié)構(gòu)為(22E，24R)-麥角甾-7，22-二烯-3β，5α，6β-三醇［(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol］。

化合物4 無(wú)色針晶(乙酸乙酯)，1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ:6.50(1H，d，J=8.5 Hz，H-7)，6.24 (1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，5.20(1H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-22)，5.16(1H，dd，J=15.5，7.8 Hz，H-23)，3.97(1H，m，H-3)，1.00(3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.90(3H，d，J=6.6 Hz，H-28)，0.88(3H，s，H-19)，0.83(3H，d，J=6.6 Hz，H-27)，0.82(3H，s，H-18)，0.81(3H，d，J=6.6 Hz，H-26)。13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:135.4(C-22)，135.2(C-6)，132.3(C-23)，130.7(C-7)，82.1(C-5)，79.4(C-8)，66.4(C-3)，56.2(C-17)，51.6(C-14)，51.0(C-9)，44.5(C-13)，42.7(C-24)，39.7(C-20)，39.3(C-12)，36.9 (C-4 and C-10)，34.7(C-1)，33.0(C-25)，30.1(C-2)，28.6(C-16)，23.4(C-11)，20.9(C-21)，20.6(C-15)，19.9(C-27)，19.6(C-26)，18.2(C-19)，17.5 (C-28)，12.8(C-18)。以上數(shù)據(jù)，經(jīng)與文獻(xiàn)［6］中數(shù)據(jù)對(duì)照基本一致，故鑒定該化合物為5α，8α-過(guò)氧-(22E，24R)麥角甾-6，22-二烯-3β-醇［5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol］。

化合物5 無(wú)色針狀結(jié)晶(氯仿-甲醇)，溴甲酚綠反應(yīng)陽(yáng)性。1H NMR(300 MHz，DMSO-d6)δ:12.13 (2H，s，COOH)，2.42(4H，s，CH2)。綜上分析，鑒定該化合物為丁二酸(amber acid)。

本文報(bào)道的化合物主要為麥角甾類化合物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，化合物1對(duì)小鼠白血病細(xì)胞P388和人白血病細(xì)胞HL-60均具有較強(qiáng)的抑制活性［3］;化合物2對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞具有抑制作用［7］;化合物4對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞tsFT210具有中等強(qiáng)度的細(xì)胞毒活性［8］。

甾體化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，廣泛存在于生物有機(jī)體內(nèi)。到目前為止，從海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的甾體化合物數(shù)量較少，但有報(bào)道稱很多從海綿等海洋生物中發(fā)現(xiàn)的甾體化合物很可能是其附生的微生物的代謝產(chǎn)物。最近研究表明很多來(lái)源于海洋微生物的甾體類化合物都具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，具有十分重要的研究與開(kāi)發(fā)價(jià)值，其作用機(jī)制更是有待于進(jìn)一步研究。

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Secondary Metabolites from Marine Fungus Fusarium sp.

LIU Tao1*，LI Zhan-lin2，WANG Yu2，TIAN Li3，4，PEI Yue-hu2，HUA Hui-ming21School of Pharmaceutical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China;2Key Laboratory of Structure-Based Drug Design＆Discovery，Ministry of Education，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China;3The First Institute of Oceanography SOA，Qingdao 266061，China;4Qingdao University of Science＆Technology，Qingdao 266042，China

Five compounds were isolated and purified from the mycelia of marine fungus Fusarium sp.by using silica gel，Sephadex LH-20，open ODS column chromatography and HPLC.On the basis of spectral data and physicochemical properties，their structures were elucidated as 3β，15β-dihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-5，8(14)，22-triene-7-one(1)，3β，5α，9α-trihydroxyl-(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-6-one(2)，(22E，24R)-ergosta-7，22-diene-3β，5α，6β-triol (3)，5α，8α-epidioxy-(22E，24R)-ergosta-6，22-dien-3β-ol(4)，and amber acid(5).Compounds 1 and 2 were isolated for the first time from this genus of marine fungus.

marine fungus;Fusarium sp.;secondary metabolite;ergosterol

1001-6880(2012)08-1047-04

2011-08-30 接受日期:2011-11-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(20872094);國(guó)家863項(xiàng)目(2007AA09Z413，2007AA09Z435)

*通訊作者 Tel:86-24-23256666-5239;E-mail:lnliutao@yahoo.com.cn

R931.77

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