鄒澤先，陳 新，張曉琳

1武漢工業(yè)學(xué)院，武漢430023;2國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京100037

發(fā)酵液中多拉菌素的提取和萃取條件研究

鄒澤先1，2，陳 新1，張曉琳2*

1武漢工業(yè)學(xué)院，武漢430023;2國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京100037

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別研究提取試劑、發(fā)酵液放置時(shí)間、pH值和溫度對(duì)發(fā)酵液中多拉菌素提取效果的影響;然后以乙酸乙酯為萃取試劑，研究萃取次數(shù)及萃取體積對(duì)多拉菌素萃取效果的影響。結(jié)果顯示，甲醇為最佳提取試劑;發(fā)酵液在pH為3～11、溫度為20～80℃的條件下放置144 h，多拉菌素均能穩(wěn)定存在，提取得到的多拉菌素的質(zhì)量濃度沒(méi)有顯著變化;濃縮提取液液經(jīng)2倍體積乙酸乙酯萃取2次即可。該條件下多拉菌素的質(zhì)量濃度和萃取率分別為151.78 μg/mL和98.00%。

多拉菌素;發(fā)酵液;萃取條件

多拉菌素(doramectin)為20世紀(jì)90年代研制開(kāi)發(fā)的新一代大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，是以環(huán)已烷羧酸(cyclohexanecarboxylic acid)為前體，通過(guò)基因重組的阿維鏈霉菌(Streptomyces avermitilis)新菌株發(fā)酵而成的一種阿維菌素類(lèi)抗生素［1，2］。經(jīng)近20年的研究，它被認(rèn)為是目前阿維菌素族中最優(yōu)秀的抗寄生蟲(chóng)藥物之一，為內(nèi)外兼殺劑，對(duì)線蟲(chóng)、節(jié)肢動(dòng)物均有良好的驅(qū)殺效果［3］，其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝具有血藥濃度高、半衰期長(zhǎng)、消除緩慢的特點(diǎn)［2］，是目前具有開(kāi)發(fā)潛力的獸用抗寄生蟲(chóng)藥物之一［4］。

多拉菌素的優(yōu)良性能使得其在養(yǎng)殖業(yè)及寵物業(yè)上應(yīng)用較為廣泛，但我國(guó)國(guó)內(nèi)對(duì)于多拉菌素的研發(fā)則還只是處于初級(jí)階段［5］，目前多拉菌素的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道多集中在其藥代動(dòng)力學(xué)研究和殘留檢測(cè)等方面［6］，包括以SPE固相萃取柱建立高通量的檢測(cè)方法［7］，以及以LC-MS快速分離并定量檢測(cè)微量殘留藥物的方法［8］，但有關(guān)多拉菌素提取及分離、純化方面則未見(jiàn)系統(tǒng)研究報(bào)道。本文旨在對(duì)多拉菌素發(fā)酵液的分離純化方面進(jìn)行探索研究，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料、儀器與方法

1.1 材料與常用儀器

1.1.1 菌種

菌種Streptomyces avermitilis XJ-8-115，由國(guó)家糧食局科學(xué)研究院篩選保藏。

1.1.2 材料

多拉菌素發(fā)酵液(國(guó)家糧食局科學(xué)研究院提供);多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma，純度97.8%;甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇鹽酸及氫氧化鈉均為分析純，由北京化工廠生產(chǎn);甲醇、乙腈為色譜純，Merck公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:可溶性淀粉30 g/L，酵母提取物2 g/L，大豆蛋白2 g/L，CoCl2·6H2O 5 mg/L，pH 7.0～7.2，250 mL三角瓶裝樣量為50 mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉70 g/L，酵母膏16 g/ L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，KCl4g/L，CoCl2·6H2O 5 mg/L，pH 7.0～7.2，250 mL三角瓶裝樣量為50 mL。

培養(yǎng)基的滅菌條件是121℃滅菌30 min。

1.1.4 儀器

高效液相色譜儀(2487檢測(cè)器，515泵，717進(jìn)樣器，美國(guó)waters公司);UV-2102 PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Unico公司);Eppendorf 5810R型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);Delta型pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司);SPY50雙層培養(yǎng)搖床(上海市離心機(jī)械研究所);SHB-III型水循環(huán)多用真空泵。

1.2 多拉菌素發(fā)酵提取液的濃縮提取液的制備

取1L多拉菌素發(fā)酵液，加入3倍的甲醇(V/ V)，震蕩搖勻，室溫下提取12 h，減壓抽濾得到上清液，減壓濃縮至原體積的1/3～1/4，即得到多拉菌素發(fā)酵液的濃縮提取液。

1.3 多拉菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)品0.0250 g，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)母液，然后再依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為300、200、100、50、20、10、5 μg/mL的多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，將多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液在以下色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。色譜柱:Agilent Nucleosil 100—5 C18，3.5 μm，250 mm×4.0 mm;流動(dòng)相:甲醇—乙腈水溶液(V甲醇∶V乙腈∶V水)= 45∶45∶10;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;柱溫:25℃。以多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 不同因素對(duì)多拉菌素發(fā)酵液提取效果的影響

1.4.1 不同的提取試劑

取5組50 mL的多拉菌素發(fā)酵液，加入3倍體積的不同有機(jī)溶劑:甲醇、乙醇、乙腈、丙酮及異丙醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，HPLC分別測(cè)定各組溶液中多拉菌素的質(zhì)量濃度，考察不同的提取試劑對(duì)多拉菌素提取效果的影響。各組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 發(fā)酵液pH

取7份50 mL的多拉菌素發(fā)酵液，分別用6 mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至3、5、原始對(duì)照(pH為6.36)、7、9、11、13，避光4℃放置8 h，再調(diào)各組溶液的pH至中性，加入3倍體積的甲醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，HPLC分別測(cè)定各組溶液中多拉菌素的質(zhì)量濃度。各組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，考察pH對(duì)多拉菌發(fā)酵液提取效果的影響。

1.4.3 發(fā)酵液的放置時(shí)間

取15組50 mL的多拉菌素發(fā)酵液，分別避光4℃放置2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120、132、144 h，加入3倍體積的甲醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，HPLC分別測(cè)定各組溶液中多拉菌素的質(zhì)量濃度。各組均設(shè)3個(gè)重復(fù)，考察不同放置時(shí)間對(duì)多拉菌發(fā)酵液提取效果的影響。

1.4.4 不同溫度

以具塞三角瓶分別取7組50 mL多拉菌素發(fā)酵液，分別置于不同溫度的水浴鍋:20、30、40、50、60、70、80℃，放置水浴鍋中8 h后，加入3倍體積的甲醇，震蕩搖勻并于室溫提取12 h后，減壓抽濾得到上清液，再取上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，HPLC分別測(cè)定各組溶液中多拉菌素的質(zhì)量濃度。各組設(shè)定3個(gè)重復(fù)，考察溫度對(duì)多拉菌素發(fā)酵液提取效果的影響。

1.5 不同因素對(duì)多拉菌素濃縮提取液的萃取效果的影響

1.5.1 萃取次數(shù)

取50 mL的多拉菌素發(fā)酵液的濃縮提取液，加入等體積的乙酸乙酯，分別萃取1、2、3次，合并每次的有機(jī)相，有機(jī)相經(jīng)減壓濃縮干燥后加入50 mL的甲醇至完全溶解，取樣經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，HPLC分別測(cè)定其中多拉菌素的質(zhì)量濃度，每組重復(fù)3次。考察不同萃取次數(shù)對(duì)多拉菌素的萃取效果的影響。

1.5.2 萃取試劑的體積

取6組50 mL的多拉菌素發(fā)酵液的濃縮提取液，加入不同體積的乙酸乙酯萃取，使V濃縮提取液∶

V乙酸乙酯分別為1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，取有機(jī)相減壓濃縮干燥后加入50 mL的甲醇至完全溶解，取樣經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，HPLC分別測(cè)定其中多拉菌素的質(zhì)量濃度。每組設(shè)定3個(gè)重復(fù)，考察不同萃取體積對(duì)多拉菌素的萃取效果的影響。

1.6 發(fā)酵液中多拉菌素質(zhì)量濃度的測(cè)定

“1.4”及“1.5”項(xiàng)下各實(shí)驗(yàn)中多拉菌素的質(zhì)量濃度的測(cè)定，均以“1.3”中多拉菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得，即以HPLC測(cè)定得到多拉菌素的峰面積，再由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其質(zhì)量濃度。

1.7 多拉菌素的萃取率的計(jì)算

萃取率=(萃取溶劑中多拉菌素的總量/提取液中多拉菌素的總量)×100%

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用Originlab 8.0軟件進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，每一個(gè)系數(shù)的顯著性通過(guò)Student t檢驗(yàn)和P值來(lái)衡量。

2 結(jié)果與分析

2.1 多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以多拉菌素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度與峰面積為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其回歸方程:Y×10-4= 1.7623X－0.4938，線性相關(guān)系數(shù)為0.9998。該標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示多拉菌素在線性范圍5～500 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確地得到多拉菌素的實(shí)際質(zhì)量濃度。

2.2 不同因素對(duì)發(fā)酵液中多拉菌素提取效果的影響

2.2.1 不同的提取試劑

實(shí)驗(yàn)表明不同的提取試劑效果差異顯著，以乙腈及甲醇的提取效果較好，它們提取得到多拉菌素的質(zhì)量濃度分別為147.37 μg/mL和142.90 μg/ mL，但兩者差異不顯著(P＞0.05);同時(shí)，甲醇的成本及毒性均較乙腈低。故提取試劑選擇甲醇。

2.2.2 發(fā)酵液pH

圖1所示即為發(fā)酵液pH對(duì)多拉菌素提取效果的影響。由圖可以看出，在pH為3～11范圍內(nèi)，多拉菌素比較穩(wěn)定;但當(dāng)發(fā)酵液pH為13時(shí)，多拉菌素已經(jīng)無(wú)法被檢測(cè)出。這可能是由于在強(qiáng)堿性條件下，多拉菌素的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使得多拉菌素發(fā)生降解或變?yōu)槠渌粗镔|(zhì)，而不能被檢測(cè)出。多拉菌素在pH為3～11范圍內(nèi)均較穩(wěn)定，提取效果良好，故提取發(fā)酵液時(shí)不需要調(diào)節(jié)pH值。

圖1 發(fā)酵液pH對(duì)多拉菌素提取效果的影響Fig.1 Effects of pH on the extraction results of doramectin

2.2.3 發(fā)酵液的放置時(shí)間

發(fā)酵液放置時(shí)間對(duì)多拉菌素提取效果的影響見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，在2～144 h內(nèi)，發(fā)酵提取液中測(cè)得的多拉菌素的含量是趨于穩(wěn)定的。所以，多拉菌素發(fā)酵液在避光條件下，放置一周是可行的。

圖2 發(fā)酵液放置時(shí)間對(duì)多拉菌素提取效果的影響Fig.2 Effects of storage time on the extraction results of doramectin

2.2.4 不同溫度

圖3所示即為溫度對(duì)多拉菌素提取效果的影響。如圖所示，在20～80℃條件下，均能提取得到多拉菌素，且提取液中多拉菌素的質(zhì)量無(wú)顯著性差異(P＞0.05);且溫度的升高，有利于蛋白等雜質(zhì)沉淀。故在20～80℃均能提取出多拉菌素，其在20～80℃條件下穩(wěn)定，選定多拉菌素的提取溫度為40℃。

圖3 溫度對(duì)多拉菌素提取效果的影響Fig.3 Effects of temperature on textraction results of doramectin

2.3 不同因素對(duì)多拉菌素萃取效果的影響

2.3.1 萃取次數(shù)

隨著萃取次數(shù)的增加，萃取率也增大。萃取1次僅能達(dá)到89.41%，萃取2次可達(dá)98%，萃取2次和萃取3次的效果則沒(méi)有明顯的差異(P＞0.05)。故從成本及試劑回收的角度，選擇乙酸乙酯對(duì)多拉菌素的濃縮提取液萃取2次即可。

2.3.2 萃取試劑的體積

隨著設(shè)定比例中乙酸乙酯與濃縮提取液體積比的增大，萃取率也隨之增大。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，當(dāng)萃取劑體積小于發(fā)酵液體積時(shí)，有明顯的乳化現(xiàn)象，待靜置較長(zhǎng)時(shí)間分層后，測(cè)得萃取率為65.57%;當(dāng)比例增大至2∶1時(shí)，萃取率增大至96.71%，與更大萃取體積得到的萃取率差異不顯著(P＞0.05)，所以綜合考慮選擇V乙酸乙酯∶V多拉菌素濃縮提取液為2∶1。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了多因素對(duì)多拉菌素提取及萃取效果的影響。結(jié)果顯示，在對(duì)提取試劑優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，得到更為廉價(jià)和低毒的甲醇作為提取試劑。多拉菌素在設(shè)定的溫度、放置時(shí)間及pH為3～11的范圍內(nèi)均較穩(wěn)定。萃取實(shí)驗(yàn)中以乙酸乙酯為萃取劑，優(yōu)化得出其與多拉菌素濃縮提取液的體積比例為2∶1，萃取2次即可。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中多拉菌素在pH為3～11時(shí)穩(wěn)定存在。在pH值為13時(shí)，檢測(cè)不到多拉菌素，故推測(cè)多拉菌素發(fā)生變化，降解至其它物質(zhì)而不能被檢測(cè)到。提取試劑實(shí)驗(yàn)中，乙腈極性較甲醇大，提取效果優(yōu)于甲醇;但是乙腈成本及毒性也都較甲醇高，且兩者提取所得多拉菌素的質(zhì)量濃度差異不顯著(P＞0.05);故選擇甲醇做完提取試劑。本文選擇3倍浸提試劑提取菌體，是由預(yù)實(shí)驗(yàn)完成并在本文驗(yàn)證，菌絲體經(jīng)3倍甲醇浸提2次即可浸提完全。

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Extraction Conditions of Doramectin in Fermentation Broth of Streptomyces avermitilis

ZOU Ze-xian1，2，CHEN Xin1，ZHANG Xiao-lin2*1Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;2Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037，China

The optimal extraction conditions of doramectin in fermentation broth of Streptomyces avermitilis were investigated by parallel experiments.Factors including distribution ratio of doramectin in fermentation broth(hyphae or supernatant)，extractants，extraction times，storage time，pH and temperature on extraction results were investigated with onefactor experiments.Meanwhile，the optimal extraction times and extracting volume were optimized based on using ethyl acetate.The optimal extraction conditions of doramectin in fermentation broth of Streptomyces avermitilis were obtained as follows:the optimal extraction solvent was methanol，and doramectin in fermentation broth could be stored for at least 144 h within the conditions of pH from 3 to 11 and temperature from 20 to 80℃.Using ethyl acetate to extract doramectin，twice was the optimal extracting time，and the twice volume of ethyl acetate and concentrated extract was the best extraction proportion.Under the optimal extraction conditions，the concentration of doramectin and its extraction rate were 151.78 μg/mL and 98.00%，respectively.

doramectin;fermentation broth;extraction condition

1001-6880(2012)01-0110-04

2011-02-17 接受日期:2011-08-31

國(guó)家“863”計(jì)劃高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目“生物獸藥新產(chǎn)品研究和創(chuàng)制”(2006AA10A208-1)

*通訊作者 Tel:86-10-81763841;E-mail:zxl@chinagrain.org

R284.2

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