錫林高娃，李詠蘭，弓 劍，呂桂芬，李傳剛

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028000；2.內(nèi)蒙古師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010022）

防御素（defensins）是廣泛分布于動物界和植物界的一類富含半胱氨酸的陽離子內(nèi)源性抗微生物肽，是內(nèi)源性抗微生物肽中的一個大家簇。在哺乳動物中表達(dá)的是α－防御素、β－防御素和θ－防御素［1］。β－防御素主要分布于哺乳動物黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)，被確認(rèn)為黏膜表面抗微生物屏障的組成成分。在綿羊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有兩種β－防御素存在［3］。小尾寒羊起源于古代北方蒙古羊，經(jīng)過長期選擇和精心培育，小尾寒羊具有早熟、多胎、多羔、生長快、體格大、產(chǎn)肉多、裘皮好、遺傳性穩(wěn)定和適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點，在世界羊業(yè)品種中被國家定為名畜良種。關(guān)于小尾寒羊防御素的研究尚未見報道。本文應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)，采用相對定量法，分析未孕和懷孕小尾寒羊子宮內(nèi)膜組織內(nèi)β－防御素mRNA的表達(dá)量，這為進(jìn)一步研究動物生殖過程中的免疫防御機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 未孕和3個月孕齡的小尾寒羊子宮內(nèi)膜（取自于呼和浩特市回民屠宰場）。屠宰后，立即刮取適量子宮內(nèi)膜放入液氮中，放入－70℃冰箱保存，備用。

1.2 RNA的提取 使用凱基Trizol法快速提取RNA。A260／A280值確定純度；1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性［4］。

1.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcription）合成cDNA按SYBR ExScript RT－PCR Kit試劑盒說明書進(jìn)行［5］。

1.4 β－防御素基因cDNA的實時熒光定量PCR根據(jù)GenBank中公布的羊的β－防御素（sBD－1、sBD－2）、（GBD－1、GBD－2）的cDNA 序列，利用計算機(jī)軟件DNAStar（Lasergene5.01）進(jìn)行基因序列的同源性比較，根據(jù)其保守區(qū)和引物設(shè)計原則設(shè)計一對PCR引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。序列為：

β－防御素基因

肌動蛋白基因

1.5 cDNA的實時定量PCR 利用反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA同時進(jìn)行目的基因（sBD）PCR和內(nèi)標(biāo)基因（β－Actin）實時定量PCR。依次加入SYBRpremis EXTaqTM10μL，cDNA模板2.0μL，上下游引物各0.5μL，滅菌蒸餾水10μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2min；95℃變性30s；55℃～60℃退火30s；72℃延伸20s；讀板，82℃溫育5s，讀板，40個循環(huán)；72℃延伸7min。70℃～95℃測定融解曲線。

以DNA Marker DL－2 000為標(biāo)準(zhǔn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其分子量。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測定出sBD基因和β－Actin基因的Ct值［6］，則sBD基因的相對表達(dá)量為2－△CT。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量RT－PCR檢測小尾寒子宮內(nèi)膜兒sBD－2表達(dá)的電泳結(jié)果 提取小尾寒羊（3月齡孕齡）子宮內(nèi)膜總RNA，PCR產(chǎn)物電泳分析見圖1。片段大小與目的產(chǎn)物大小一致。為排除基因組污染對PCR體系造成的影響，設(shè)陰性對照（圖1中1、4），在相同條件下不加反轉(zhuǎn)錄酶AMV，結(jié)果顯示無擴(kuò)增產(chǎn)物，說明該產(chǎn)物是以mRNA為模板擴(kuò)增而來。

2.2 子宮內(nèi)膜sBD基因PCR產(chǎn)物電泳檢測及基因測序結(jié)果 取未孕和孕齡3個月子宮內(nèi)膜組織經(jīng)總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實時熒光定量PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果見圖2。

圖2表明，小尾寒羊子宮內(nèi)膜sBD基因擴(kuò)增片段為303bp，β－Actin擴(kuò)增片段為310bp，與設(shè)計擴(kuò)增片段大小一致。

圖1 熒光熒光定量PCR電泳結(jié)果

其cDNA序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫，采用BLASTN進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，小尾寒羊子宮內(nèi)膜組織的sBD基因cDNA與文獻(xiàn)Ovis aries sBD－2基因的cDNA間有99%的同源性（299／300）。

2.3 子宮內(nèi)膜mRNA相對定量測定 對20例未孕和懷孕小尾寒羊子宮內(nèi)膜mRNA進(jìn)行相對定量測定，用2－△Ct表示子宮內(nèi)膜mRNA相對表達(dá)量值。未孕和懷孕小尾寒羊子宮內(nèi)膜mRNA的表達(dá)量分別為2－8.95和2－5.58。

圖2 sBD、β－Actin基因PCR產(chǎn)物凝膠電泳

對上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列為：

GCCAGCATGAGGCTCCATCACCTGCTCCTCGTGCTTTTCTTCGTGGTCCTGTCTGCTGGG TCAGGATTTACTCATGGAGTAACAGATAGTCTAAGCTGCCGTTGGAAGAAAGGCATCTGTG TGCTGACCAGGTGCCCTGGAACCATGAGACAGATTGGCACCTGTTTCGGGCCCCCAGTAAAA TGCTGCAGACTGAAGTAACAGAAGGCGAAGACGCGGCCGGGACCGATGCGGAGTCAGAAAT GCTGCAGACTGAAGTAACAGAAGGCGAAGACGCGGCCGGGACCGATGCGGAGTCAGAA

3 討論

已有學(xué)者通過Northern blot雜交進(jìn)行了不同日齡羔羊β－防御素mRNA的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從7日齡開始就有sBD－1的mRNA少量出現(xiàn)，在49日齡羔羊瘤胃內(nèi)sBD－1的mRNA最豐富，以后又逐漸減少［7］。由此可見，β－防御素的表達(dá)不僅有組織特異性，而且與它的發(fā)育階段有關(guān)。在α－防御素中也存在組織表達(dá)特異性和發(fā)育階段表達(dá)特異性。1996年Mallow E B等研究出生前后胎兒、嬰兒及成人小腸內(nèi) HD－5、HD－6的基因時發(fā)現(xiàn) HD－5在13.5～17周間的小腸結(jié)腸的都有二者的表達(dá)，但到了17周時，HD－5僅在小腸中表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)人小腸α－防御素HD－5和HD－6在胎兒、嬰兒和成人腸道內(nèi)的表達(dá)不同，即胎兒小腸內(nèi)α－防御素的表達(dá)量比新生兒低，新生兒又比成年人低，同樣在各個階段HD－5的表達(dá)量比HD－6高［8］。由此揭示了防御素的表達(dá)與動物體接觸的環(huán)境因素密切相關(guān)。同時，原位雜交方法研究24周齡胎兒的潘氏細(xì)胞中防御素mRNA表達(dá)情況比相應(yīng)地成體中及出生嬰兒中的潘氏細(xì)胞表達(dá)的要低，這正是未成熟的防御水平的特征。對蒙古綿羊發(fā)育過程中β－防御素的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，sBD－2基因在十二指腸、肺、子宮中的表達(dá)均呈一致性增長趨勢，提示防御素的表達(dá)調(diào)控可能受到環(huán)境因素的多因子的動態(tài)影響［9］。

本試驗發(fā)現(xiàn)，懷孕3個月齡的小尾寒羊子宮內(nèi)膜組織β－防御素mRNA的表達(dá)量明顯高于未孕子宮，表明β－防御素mRNA的表達(dá)隨機(jī)體的機(jī)能狀態(tài)會發(fā)生變化，在生殖生理的機(jī)體免疫中有著重要的作用。為進(jìn)一步研究β－防御素mRNA的表達(dá)與生殖生理的機(jī)體免疫機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

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