高 玲，張 丹，曹 軍，郭 棟，楊瑞章，于伯華

(1.鹽城出入境檢驗檢疫局檢測中心，江蘇鹽城 224002;2.江蘇出入境檢驗檢疫局，南京 200001)

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛的作為治療藥物使用，在眾多抗生素類藥物添加劑中，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素占有較為重要的地位[1]。抗生素殘留是指因動物在接受抗生素治療或食入抗生素飼料添加劑后，抗生素及其代謝物在動物的組織及器官內(nèi)蓄積或貯存。食品殘留發(fā)生急性中毒的可能性極小，這種長期、低水平的接觸方式主要產(chǎn)生各種慢性、蓄積毒性，如“三致(致癌、致畸、致突變)”、免疫毒性、發(fā)育毒性和生態(tài)毒性等，對健康和環(huán)境的危害往往具有隱蔽性，易造成實質(zhì)性和難以扭轉(zhuǎn)的危害[2]。

目前，國外對動物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留檢測開展的比較廣泛，已有較多文獻對此進行了研究與探討，而國內(nèi)相關(guān)檢測文獻較少，僅有少數(shù)有關(guān)HPLC分析某一種大環(huán)內(nèi)酯[3-4]或LCMS/MS進行大環(huán)內(nèi)酯多殘留檢測[5-6]的報道，但目前國內(nèi)液質(zhì)聯(lián)用法測定大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的研究報道較少。本文通過對比3種水產(chǎn)品中不同的大環(huán)內(nèi)酯類類藥物提取方法，最終利用乙腈超聲提取，能夠快速簡便地檢測水產(chǎn)品中的10中大環(huán)內(nèi)酯類藥物。大量的進出口水產(chǎn)品樣品檢測結(jié)果表明，該方法能夠滿足目前進出口已經(jīng)國家殘留監(jiān)控的標準。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料 Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra液相色譜-高分辨串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧電離源。

甲醇、乙腈 (色譜純，Merck)，甲酸(色譜純，F(xiàn)luka)，碳酸鈉、碳酸氫鈉 (分析純，南京化學試劑廠)，水為重蒸蒸餾水。

螺旋霉素Ⅰ(Spiramycin I SPR)、替米考星(Tilmicosin TIL)、林可霉素(Lincomycin LINCO)、紅霉素(Erythromycin ERM)、羅紅霉素(Roxithromycin ROM)、泰樂菌素 A(Tylosin TYL)、吉他霉素(Kitasamycin KIT)、交沙霉素(Josamycin JOS)、竹桃霉素(Oleandomycin OLE)、克林霉素 (Clindamycin CLN)購自Sigma-Aldrich公司，純度＞98%。

標準儲備液:稱取適量的標準品，使用甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備液。

標準工作溶液:使用甲醇-水(體積比為3∶7)稀釋標準儲備液至所需的質(zhì)量濃度。

水產(chǎn)品樣品為各地送檢樣品。

1.2 HPLC-MS/MS條件 HPLC條件:Hypersil Gold C18 色譜柱 (100 mm ×2.1 mm，5 μm);流動相A相為甲醇，流動相B相為0.1%甲酸水溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脫程序見表1;柱溫為室溫;進樣體積為20 μL;分析時間為12 min。

表1 大環(huán)內(nèi)酯類藥物色譜分離的線性梯度洗脫程序

MS/MS條件:電噴霧離子化源，正離子方式檢測;10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物質(zhì)譜定性定量數(shù)據(jù)見表2。1.3 樣品提取 準確稱取組織(鮰魚、龍蝦)樣品(5.00±0.05)g于50 mL離心管中，加入相應(yīng)濃度的混標渦旋20 s，加入20 mL乙腈提取液，渦旋后超聲提取15 min，再加入4 g無水硫酸鈉旋渦3 min，離心(3500 r/min，10 min)，殘渣用 10 mL 提取液再提取一次，合并濾液。于水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，準確加入1.00 mL甲醇水混合溶液(體積比2∶8)和0.5 mL正己烷渦旋后高速離心(12000 r/min，10 min)脫脂，取下層清液過0.45 μm的濾膜到進樣瓶中，準備進樣。

表2 10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的母離子和選擇離子及碰撞能

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化方式的選擇 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液和極性溶劑，如甲醇、乙腈等[7]。在中性水溶液中相對較穩(wěn)定，但酸性條件下易發(fā)生水解，特別是紅霉素，即使很稀的醋酸溶液也能使其分解。根據(jù)文獻[8-9]報道，采用酸化的甲醇溶液提取，結(jié)果表明，林可霉素、紅霉素、螺旋霉素和阿奇霉素的回收率均小于60%，可見這4種化合物的酸解較為嚴重。本研究采用乙腈提取，正己烷凈化[10]，10種大環(huán)內(nèi)酯類化合物均得到較好的回收率，且前處理步驟簡單。

本文還對比了液-液萃取和固相萃取方法。液-液萃取的方法簡單方便，但雜質(zhì)較多。固相萃取方法相對成本較高但提取和凈化一步完成有利用于實現(xiàn)自動化操作。水產(chǎn)品樣品用0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH=9.3)緩沖溶液提取，然后在Oasis HLB柱上凈化。大環(huán)內(nèi)酯類藥物在酸性條件下(pH＜4.0)不穩(wěn)定，而在堿性條件下(pH=9.3)提取，既可以避免藥物分解，又可以使帶氨基的藥物保持分子形式，提高藥物的固相萃取回收率和穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)獲得的回收率與上法相差不大?？紤]到乙腈直接提取方法在大環(huán)內(nèi)酯類藥物提取上已經(jīng)能夠獲得足夠的回收率，且可以較大降低檢測成本，因此后面都采取了乙腈直接提取的前處理方法。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在正離子模式下，分別對1 mg/L的10種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的標準溶液進行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各分子離子的錐孔電壓。再分別以上述離子為母離子，對其子離子進行全掃描，選擇豐度較高、干擾較小的兩對子離子為定性離子，豐度最大的作為定量離子，并優(yōu)化其碰撞能量。10種大環(huán)內(nèi)酯的優(yōu)化質(zhì)譜條件見表2。

不同的色譜柱對同一樣品有不同的保留時間。實驗使用幾種不同的反相色譜柱進行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在現(xiàn)有的色譜洗脫條件下，Thermo Fisher公司的 Hypersil Gold C18柱(100 mm ×3.5 mm，5 μm)由于填料顆粒細，使峰形更加對稱尖銳，信噪比更高，因此本文最終選擇該色譜柱作為分離柱。在流動相中加入適量的甲酸(0.1%)，可以提高靈敏度。在現(xiàn)有的色譜條件下進行色譜分離，10種大環(huán)內(nèi)酯類分析物，除了林可霉素保留時間較小，其余9種大環(huán)內(nèi)酯藥物保留時間均在6～8 min內(nèi)，在2 min左右全部被洗脫下來，且大部分色譜峰重疊在一起，每個色譜峰的底寬約14 S，見圖1。為了使每一個色譜峰有足夠的掃描點(duty cycle)，優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)。在1.2項的優(yōu)化條件下，每個子離子的掃描駐留時問為5 ms，每個子離子切換時間為3 ms，每個分析物色譜掃描點在25個以上，保證每個色譜峰有良好的重現(xiàn)性。

2.3 方法的定性、定量、線性范圍、回收率和精密度 進行樣品測定時，若樣品的色譜峰保留時間與標準品一致，并且在扣除背景后的待測物進行監(jiān)測的全部特征離子的相對豐度應(yīng)與標準品一致，離子豐度與濃度接近的標準溶液偏差在規(guī)定范圍內(nèi)[11]，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。采用不含大環(huán)內(nèi)酯類藥物的龍蝦、鮰魚為樣品基質(zhì)空白，制備 5、10、20、50、100、200 μg/kg 的 10 種抗生素樣品的混合標準系列標準液，進樣測定。以標準品與內(nèi)標物峰面積比值Y為縱坐標，工作溶液的質(zhì)量濃度X(μg/L)為橫坐標，繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量，樣品溶液的響應(yīng)值均在儀器測定的線性范圍內(nèi)。在5～200 μg/kg范圍內(nèi)10種抗生素標準曲線線性均為良好，線性相關(guān)系數(shù)R＞0.99。由下表可以發(fā)現(xiàn)，本實驗用于提取基質(zhì)中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法，回收率穩(wěn)定在60% ～120%之間;日內(nèi)精密度小于11%，完全滿足日常分析檢驗的需要。對陰性龍蝦和鮰魚進行加標實驗(5、20、50 μg/kg)，數(shù)據(jù)及計算結(jié)果如表3和表4所示。

圖1 空白龍蝦樣品中添加10種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的選擇離子色譜圖(加標水平5 μg/kg)

表3 龍蝦加標回收率和精密度

表4 鮰魚加標回收率和精密度

3 結(jié)論

建立了HPLC-MS/MS同時測定水產(chǎn)品中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的檢測方法。采用乙腈做溶劑，超聲提取，進一步有效去除基質(zhì)干擾，方法快速簡潔，靈敏度、檢出限、精密度等指標均滿足國內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，可為水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的監(jiān)督檢驗和殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持，適合大量進出口水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測。

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