羅成江，陳慧華，林仙軍，韋敏玨，周 煒，應(yīng)永飛

(浙江省獸藥監(jiān)察所，杭州 310020)

超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的新型液相色譜檢測(cè)技術(shù)，采用了2.0 μm以下顆粒度的色譜柱填料，能夠獲得更高的柱效，并且在更寬的線速度范圍內(nèi)柱效保持恒定，因而有利于提高流動(dòng)相流速、縮短分析時(shí)間和提高分析通量。相對(duì)于傳統(tǒng)HPLC而言，UPLC具有更好的分離效率、峰容量以及靈敏度，為復(fù)雜體系的分離分析提供了良好的技術(shù)平臺(tái)[1]。

磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)是具有對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，是常用的廣譜抗菌藥。因其具有抗菌譜廣、高效、低毒和價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在動(dòng)物養(yǎng)殖中被廣泛使用。人類經(jīng)常食用有磺胺類藥物殘留的動(dòng)物源性食品，可能引起磺胺類藥物在體內(nèi)的逐漸累積.其危害性主要表現(xiàn)為細(xì)菌耐藥性、過(guò)敏、造血紊亂、致癌作用以及激素樣作用等[2-3]。目前中國(guó)、歐盟、美國(guó)、日本等均將磺胺類藥物列為動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中限制使用的藥物。其最大殘留限量一般為50～100 μg/kg。本文采用農(nóng)牧發(fā)[2001]38號(hào)動(dòng)物源食品中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)方法[4]，分別在UPLC儀器和HPLC儀器上同時(shí)對(duì)磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺甲惡唑(SMZ)、磺胺喹惡啉(SQ)5種磺胺在豬肉中的殘留量測(cè)定，并比較2種方法測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明HPLC分析方法能夠成功地轉(zhuǎn)換并優(yōu)化為UPLC方法，既達(dá)到了樣品分析的高通量又得到更高的分析靈敏度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent 1100高效液相色譜儀-UV檢測(cè)器，Waters Symmetry C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm);Waters Acquity UPLC 超高效液相色譜儀-UV檢測(cè)器，Waters Acquity UPLC BEH RP18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)。XS-205 電子天平(Mettler公司);SL502 N電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司);KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);3k30型冷凍離心機(jī)(Sigma公司);N-EVAPTM112型氮吹儀(美國(guó)Organomation公司);20通道固相萃取裝置(Waters公司);MS2 minishaker渦旋混勻器(IKA公司)。色譜純乙腈，甲醇;分析純磷酸，正己烷，正丙醇，無(wú)水硫酸鈉;去離子水?；前范谆奏ぁ⒒前范籽踵奏?、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑標(biāo)準(zhǔn)品:購(gòu)自SIGMA公司，含量均不少于99%。固相萃取柱:Waters Sep-Pak堿性氧化鋁柱，2 g/12 cc。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制(500 μg/mL):分別準(zhǔn)確稱取磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉和磺胺甲惡唑50.0 mg(準(zhǔn)確至0.1 mg)，置于100 mL容量瓶，用少量甲醇溶解，并用甲醇定容至刻度，混勻，濃度為500 μg/mL，置于4℃冷藏避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別精密量取1.00 mL 5種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容至100 mL，濃度為5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于4℃冷藏避光保存。

1.2 樣品前處理

1.2.1 制樣 取適量空白豬肉樣品絞碎勻漿，作為空白試料，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)濃液，作為空白添加試料。

1.2.2 提取與凈化 稱取組織樣品5 g(精確到0.1 g)，加入乙腈25 mL，無(wú)水硫酸鈉少許，渦旋震蕩15 s后，以4000 r/min的速度離心5 min。上清液移至分液漏斗中，分離后的殘?jiān)儆?5 mL乙腈提取處理，渦旋震蕩15 s后，以4000 r/min的速度離心5 min。合并兩次的上清液，加入正己烷30 mL毫升，振搖2 min后，靜置分層，取下層液體，加入正丙醇10 mL，50℃下減壓濃縮至近干，殘留物用95%乙腈3 mL溶解，過(guò)Waters Sep-Pak堿性氧化鋁柱(預(yù)先經(jīng)5 mL 95%乙腈活化)。用95%乙腈5 mL淋洗，再用70%乙腈10 mL洗脫后，洗脫液中加入5 mL正丙醇，50℃下減壓濃縮至近干，殘留物用2.0 mL流動(dòng)相溶解，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，收集濾液作為試樣溶液，供液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 分析條件

1.3.1 HPLC色譜條件 色譜柱:Waters symmetry C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈 -甲醇 -水 -乙酸(2 ∶2∶9 ∶0.2)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量50 μL

1.3.2 UPLC色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH RP18柱(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相:乙腈 -甲醇 -水 -乙酸(2∶2∶10∶0.2)，流速0.4 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量 5 μL。

1.4 測(cè)定法 取適量相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和試樣溶液注入液相色譜儀，作單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)，以色譜峰面積定量。標(biāo)準(zhǔn)工作液及試樣中磺胺類藥物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)，試樣液測(cè)定過(guò)程中要參插注入標(biāo)準(zhǔn)工作液，以便準(zhǔn)確定量。

2 UPLC方法學(xué)考察

2.1 線性關(guān)系考察 精密量取標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，加甲醇稀釋制成為 0.01、0.05、0.10、0.25、0.50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按設(shè)定色譜條件進(jìn)行線性分析，以溶液濃度(μg/mL)為X，以峰面積為Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，各種化合物的質(zhì)量濃度在10～500 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9990。

2.2 儀器精密度試驗(yàn) 取50 ng/mL對(duì)照品溶液，在UPLC儀器上重復(fù)進(jìn)樣6次，各磺胺類藥物峰面積的RSD為0.5%。表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液5 μL，分別于 0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得各藥物峰面積的RSD為0.5%。

2.4 添加回收率的驗(yàn)證 取空白樣品試料分別向其中加入 50 μg/kg、100 μg/kg 和 200 μg/kg 濃度的磺胺類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。進(jìn)行提取、凈化及色譜分析。每個(gè)添加水平作5份平行測(cè)定，結(jié)果表明:平均回收率為70.5% ～101%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9% ～11.0%，結(jié)果見表1。

表1 豬肉中5種磺胺類藥物的添加回收率和精密度

3 豬肉中磺胺類藥物殘留在HPLC和UPLC中的測(cè)定結(jié)果比較

取同一批號(hào)的空白豬肉樣品，加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，使磺胺類藥物的加標(biāo)濃度為100 μg/kg，按1.2.2項(xiàng)下的方法處理后，按各自液相色譜檢測(cè)條件檢測(cè)磺胺類藥物的殘留量。每個(gè)濃度點(diǎn)取5份樣品，求其平均回收率。結(jié)果表明，UPLC和HPLC方法所測(cè)得的豬肉中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定結(jié)果一致，結(jié)果見表2，色譜圖比較見圖1和圖2。

圖1 磺胺類藥物殘留測(cè)定的HPLC圖譜

圖2 磺胺類藥物殘留測(cè)定的UPLC圖譜

表2 UPLC與HPLC儀測(cè)定豬肉中磺胺類藥物殘留結(jié)果比對(duì)

4 討論

4.1 流動(dòng)相的選擇 以UPLC法考察不同比例的各溶劑系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將流動(dòng)相:乙腈 -甲醇-水-乙酸(2∶2∶9∶0.2)調(diào)整為乙腈-甲醇-水-乙酸(2∶2∶10∶0.2)時(shí)，分離度及峰形更好。

4.2 小結(jié) 本試驗(yàn)中以UPLC法測(cè)定豬肉中磺胺類藥物殘留的檢測(cè)按農(nóng)牧發(fā)[2003]1號(hào)《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范(試行)》進(jìn)行了方法學(xué)研究，符合要求。本試驗(yàn)根據(jù)農(nóng)牧發(fā)[2001]38號(hào)測(cè)定項(xiàng)下方法，比較了UPLC法與HPLC法磺胺殘留測(cè)定結(jié)果，可看出兩法測(cè)定結(jié)果誤差在規(guī)定范圍以內(nèi)。UPLC法具有快速、高分離度等優(yōu)勢(shì)，將HPLC定量方法轉(zhuǎn)換并優(yōu)化為UPLC方法，在保證含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的前提下，將提高色譜峰分離度，減少溶劑損耗及廢液處置費(fèi)用，減少分析時(shí)間，降低分析成本，提高了分析通量。

[1]Wirth M J.Mass transport in sub-2- μm high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2007，1148(1):128.

[2]段振娟，張鴻雁，王 碩.動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留分析研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2007，28(6):149-152.

[3]萬(wàn)春花，龍洲雄.磺胺類藥物殘留的色譜分析進(jìn)展[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2008，18(2):99-104.

[4]農(nóng)業(yè)部動(dòng)物性食品中獸藥殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)匯編[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2009:179-183.

[5]農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2003]1號(hào).關(guān)于發(fā)布《獸藥殘留試驗(yàn)技術(shù)規(guī)范(試行)》的通知[S].