張培晏 陳民香

（1.四川省廣元市元壩區(qū)動物疫病預防控制中心，廣元 628021；2.四川省廣元市動物疫病預防控制中心，廣元 628017）

1 前言

鴨疫里默氏桿菌[1]是一種無芽孢、不運功、有莢膜的G-小桿菌，主要感染家鴨、鵝、火雞等[2]，感染后病鴨多表現為眼鼻有分泌物，共濟失調等。慢性耐過鴨生長緩慢，主要表現神經性癥狀，導致殘鴨和僵鴨。花邊肉鴨是利用廣西大麻鴨作母本、快大型品種櫻桃谷肉鴨作父本[3]雜交種，具有抗病力及適應性強、肉質風味好、生產性能及商品性能都較佳、制種成本優(yōu)廉等特性，主要分布于湖北、湖南、廣西、四川等地。鴨疫里默氏桿菌（RA）作為主要病原菌之一，給川渝地區(qū)花邊肉鴨的飼養(yǎng)造成了極大的損害。本課題就RA對不同日齡花邊肉鴨的感染情況進行探究，旨在找出花邊肉鴨對此菌最易感日齡，為該病疫苗研制及預防花邊肉鴨患病提供參考。

2 材料與方法

2.1 基礎種子

AF株RA基礎毒株。

2.2 實驗動物

健康1日齡花邊肉鴨84只（SM3櫻桃谷肉鴨為父本與本地麻鴨母本雜交1代）和健康家兔1只均購置本地。

2.2.1 主要儀器 超低溫冰箱、4℃冰箱、紫外分光光度計、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、壓力蒸汽滅菌器、1次性注射器、酒精燈、接種環(huán)、培養(yǎng)皿等。

2.2.2 主要藥品與試劑 胰化蛋白胨、酵母抽提物、瓊脂粉、氯化鈉、AF株RA的標準血清；鴨肝炎蛋黃抗體。

2.3 方法

2.3.1 培養(yǎng)基及試劑的配制 巧克力瓊脂平板參照文獻[4]配制；0.9%NaCl溶液：NaCl9.0 g，用蒸餾水定容至1.0L，搖動容器直至溶質溶解，滅菌備用。

2.3.2 實驗鴨及飼養(yǎng) 健康1日齡花邊肉鴨，隨機分組，腳蹼烙孔逐羽編號。飼養(yǎng)至攻毒日齡，攻毒時轉移至染疫舍中。除1日齡注射精制鴨肝炎蛋黃抗體（自制品）1ml外，實驗鴨在試驗期間未使用其他藥物。

2.3.3 菌懸液的制備 基礎種子解凍，超凈臺內傳CLBA，37℃，18h～24 h培養(yǎng)，檢驗合格后，無菌生理鹽水（PS）洗下菌苔，制成菌懸液。

2.3.4 攻毒試驗

2.3.4.1 AF株RA對不同日齡花邊肉鴨攻毒 隨機分組，每組實驗鴨11只，見表1。試驗組于6、8、10、18、28、43日齡時自健康隔離飼養(yǎng)舍轉到染疫舍中攻毒，實驗鴨每只注射0.2 ml[5]攻毒菌液，對照組每只接種0.2 ml PS。

2.3.4.2 攻毒后觀察 觀察期為7 d，每天上下午各1次，逐只觀察，記錄發(fā)病和死亡鴨腳蹼號碼。凡出現行走異常、精神沉郁、廢食、體重特輕、偏頸、死亡或存活鴨撲殺后見明顯病變者判為發(fā)病。

2.3.4.3 菌回收實驗 無菌取病死鴨或存活撲殺鴨的腦、心血、肝臟病變組織，接種CLBA，37℃培養(yǎng)，24 h后觀察菌落形態(tài)。若菌落不純或無單個菌落存在，傳代培養(yǎng)，直止得到單個菌落。

2.3.4.4 玻片凝集試驗[6]在干凈玻片上滴蒸餾水l滴，用接種環(huán)挑取待檢菌的純培養(yǎng)物少許與蒸餾水混勻，滴加未稀釋的AF株RA陽性血清l滴，將載玻片輕輕擺動或用接種環(huán)涂開，觀察現象并得出結論。

3 結果

3.1 臨床癥狀

健康鴨6日齡開始發(fā)病，10日齡死亡。病鴨表現為縮頸，不愿走動，喙抵地面；排白色或綠色稀糞，部分雛鴨腹部膨脹；喙和蹼發(fā)紫、發(fā)紺；兩肢軟弱，跛行或臥地不起，行走打晃、轉圈、倒退、前仰后翻，翻倒后仰臥不易翻轉；頻死期出現神經失調，兩肢伸直呈角弓反張狀態(tài)。

3.2 剖檢病變

病死鴨剖解可見全身漿膜有纖維素性滲出物覆蓋；氣囊增厚；心包有大量黃白色纖維索性滲出物；肝表面有一層黃白色纖維索性假膜，易剝離。同時有的肝臟腫脹、變性、質脆并有出血點；腦膜出血、水腫。

3.3 菌回收實驗

菌落直徑1～2.0 mm，呈奶油狀、透明、圓形、凸起的鮮露珠樣。玻片凝集實驗：幾秒鐘后出現清晰的乳白色絮狀凝集塊，陽性反應。

3.4 發(fā)病率及死亡率統(tǒng)計

約10倍LD50菌量，即2.4×109CFU/ml菌液0.2ml攻擊不同日齡花邊肉鴨，詳細結果見表1～表3。

表1 AF株RA對6～43日齡花邊肉鴨的感染試驗結果

表2 AF株RA對6～43日齡花邊肉鴨攻毒后發(fā)病情況統(tǒng)計

表3 AF株RA對6-43日齡花邊肉鴨攻毒后各天死亡情況

4 分析與討論

4.1 AF株RA對花邊肉鴨易感性

據調查，SI是花邊肉鴨的多發(fā)病和常發(fā)病。RA菌株中，血清1型占50%以上，為主要流行型[7、8]。本試驗結果表明AF株RA對6～43日齡花邊肉鴨均有很強致病力，除6日齡發(fā)病率為72.7%和死亡率為45.5%外，各組發(fā)病率和死亡率都達到80%?；ㄟ吶怿?4～43日齡，除14日齡組發(fā)病率達到63.6%外，其余各組均超過80%，除14日齡死亡率僅為36.3%外，其余各組均達到60%5]。可以看出AF株RA對花邊肉鴨有很強的感染力，對其一生均高度易感。

4.2 花邊肉鴨對AF株RA的最敏感期

花邊肉鴨對AF株RA的最敏感時期是8日齡、18日齡。葉玉梅等[5]報道18～20日齡是AF株RA感染花邊肉鴨和櫻桃谷肉鴨的最敏感時期。本次試驗與其基本一致。從表1看出，8和18日齡發(fā)病率和死亡率都為100%和90.9%。從表2和表3看出，18日齡健康鴨攻毒后第2 d發(fā)病率達63.6%；第4 d全部發(fā)病且死亡率達54.5%。因此，在花邊肉鴨的養(yǎng)殖中要高度重視RA日齡時期的環(huán)境衛(wèi)生和之前的疫苗預防及藥物預防。

4.3 免疫保護期

AF株RA油乳劑滅活疫苗免疫4日齡花邊肉鴨和櫻桃谷肉鴨后，疫苗接種疫苗后10 d保護率可達80%左右。4日齡櫻桃谷肉鴨接種AF株RA油乳劑滅活疫苗后50 d，達到80%以上的保護效果[5]。根據一般的油乳劑滅活疫苗誘導期通常為7～14 d，我們建議在疫苗預防方面1日齡花邊肉鴨用滅活油乳劑苗1免，7日齡加強免疫1次。

5 結論

AF株RA對6～43日齡花邊肉鴨均有很強致病力，除6日齡發(fā)病率為72.7%和死亡率為45.5%外，各組發(fā)病率和死亡率都達到80%。8、18日齡為AF株RA感染花邊肉鴨的最敏感日齡。

[1]Higgins D.A.，R.R.Henry，Z.V.Kounev.Duck immune responses to Riemerella anatipestifer vaccines[J].Developmental and Comparative Immunology .2000,（24）：153-167

[2]蔡寶祥主編.家畜傳染病學（第四版）[M].北京：中國農業(yè)出版社.2007

[3]廖遠勤.經濟雜交禽（雞、鴨）特性的觀察和分析[J].四川畜牧獸醫(yī)，2003，6：27-28

[4]J.薩母布魯克D.W 拉塞爾著 黃培堂.等譯.分子克隆實驗指南（第三版）[M].2002

[5]葉玉梅.雞抗RA蛋黃抗體消除油乳劑滅活疫苗免疫空白期的研究.2009

[6]汪銘書，程安春等.血清5型鴨疫里氏桿菌在我國的發(fā)現及其病原特性研[J].2002，32（7）：16-20

[7]李繼祥，徐剛，王孝友等.重慶地區(qū)鴨傳染性漿膜炎病原分離鑒定[J].中國家禽，2005，27（13）：8-11

[8]黃承洪，李繼祥，黃偉等.重慶和四川地區(qū)鴨疫里默氏桿菌流行動態(tài)研究.中國預防獸醫(yī)學報2007，29（1）：67-69