李 軍 ，黃 霞 ，姚雪梅 ，陳雪芬 ，齊興柱

1.熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南海口 570228；2.海南大學海洋學院，海南?？?570228

E.coli DH10B堿性磷酸酶基因的克隆、表達及活性研究

李 軍1,2，黃 霞2，姚雪梅2，陳雪芬2，齊興柱2

1.熱帶生物資源教育部重點實驗室，海南?？?570228；2.海南大學海洋學院，海南海口 570228

目的：克隆并表達E.coli DH10B堿性磷酸酶（AKP）成熟肽基因（phoAm），為AKP的定向改構(gòu)及應用奠定基礎(chǔ)。方法：采用PCR法從E.coli DH10B基因組擴增phoAm；將phoAm克隆入表達載體pET28a，再轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）進行表達；用免疫金層析法和SDS-PAGE法檢測表達的重組rAKP；采用對硝基酚磷酸（pNPP）法測定rAKP的活性。結(jié)果：rAKP單體分子量約47 K，活性分析比對照菌提高21.5倍。結(jié)論：獲得AKP成熟肽基因并得了到具有較高活性的重組rAKP。

堿性磷酸酶；大腸桿菌DH10B；表達純化；活性分析

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一類非特異性磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯的水解[1]。AKP廣泛存在于多種細菌、真菌和動物中。不同來源的AKP的相對分子質(zhì)量和編碼序列差異很大，且各種AKP的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能和催化機制也不完全相同。其中，E.coli AKP由phoA基因編碼，為同源二聚體金屬酶，單體由449個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為47 K，活性中心包括3個金屬原子，即2個鋅原子和1個鎂原子[2]。

E.coli AKP催化機制明確，底物范圍廣泛，作為工具酶在表位連鎖、組織化學、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應用。E.coli DH10B無致病性和耐藥基因，是基因克隆的常用受體菌。本研究首次從E.coli DH10B基因組中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并進行了表達研究，從而為此種酶的結(jié)構(gòu)、功能和應用研究打下了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體 大腸桿菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21（DE3）、E.coli DH5α及原核表達載體pET28a（+）由熱帶生物資源教育部重點實驗室保存。

1.1.2 試劑 T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、對硝基苯磷酸（pNPP）購自生工生物（上海）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、Pfu DNA聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司。His標簽蛋白純化試劑盒、重組標簽蛋白快速檢測試劑盒GoldCassette-HIS購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3 引物 引物設計后由生工生物（上海）有限公司合成。

1.1.4 儀器 UV-2450紫外可見分光光度計（島津）；超微量黑色石英比色皿（島津）；PCR擴增儀（2720 Thermal Cycler Applied Biosystems）；凝膠成像系統(tǒng)（BioRad）。

1.2 方法

1.2.1 E.coli DH10B基因組DNA的提取與純化 E.coli DH10B甘油菌經(jīng)LB培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)后，用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取與純化。提取的基因組DNA用紫外分光光度法進行評價。

1.2.2 引物設計 從Genbank數(shù)據(jù)庫下載E.coli DH10B的phoA 基因序列（accession number：NC-010473），使用 Primer Premier 6.0和Oligo 7.37輔助設計用于擴增AKP phoAm的引物，為便于克隆進表達載體pET28a中，在引物兩端加上適當?shù)拿盖形稽c和保護堿基。設計的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5'-GCGACAAGCTTTATT TCAGCCCCAGAGC-3'（HindⅢ）。

1.2.3 PCR法擴增phoA基因 在0.2 ml PCR管內(nèi)配制50 μl反應體系，按下述程序進行PCR擴增：94℃預變性3 min；擴增 30個循環(huán)， 即 94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 2 min；72℃延伸5 min。反應結(jié)束后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測并進行測序。

1.2.4 phoAm基因的克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，并與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的表達載體pET28a（+）經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)LB/kan篩選平板培養(yǎng)后，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 phoAm基因的誘導表達 分別接種pET28a-phoAm/BL21（DE3）和 pET28a/BL21（DE3）單菌落至 5 ml LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例接種陽性菌液至100 ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600nm約為0.4時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.2.6 重組蛋白（rAKP）的檢測 菌體離心后，加入緩沖液超聲破碎，離心取上清液，用免疫金層析法檢測6×His標簽，用SDS-PAGE法檢測表達蛋白。

1.2.7 重組蛋白（rAKP）的純化 采用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒進行純化。對洗脫液進行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

1.2.8 重組蛋白（rAKP）的活性分析 采用對硝基酚磷酸（pNPP）法測定rAKP的活性。取發(fā)酵菌體超聲破碎后的上清液，加入測活液，30℃反應10 min，加入終止液終止反應，于波長410 nm處測吸收值。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增E.coli DH10B成熟肽基因（phoA）

PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分析，可見1.4 kb的條帶（圖1）大小與預期一致。

圖1 E.coli DH10B phoAm PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 重組蛋白（rAKP）的表達與檢測

重組菌誘導表達后，取超聲破碎后的上清液，分別用免疫金層析法快速檢測6×His標簽（圖2），用SDS-PAGE法檢測表達蛋白（圖3）。rAKP的分子量約為47 K。

圖2 免疫金層析法快速檢測His標簽蛋白

圖3 SDS-PAGE檢測誘導表達的rAKP

2.3 重組蛋白（rAKP）的活性分析

rAKP經(jīng)活性分析，對照菌 E.coli BL21（DE3）的 OD405nm為 0.120，重組菌 E.coli BL21（DE3）/phoAm 的 OD405nm為2.58，即重組菌的堿性磷酸酶活性提高21.5倍。

3 討論

本研究首次從E.coli DH10B菌株的基因組中克隆了堿性磷酸酶成熟肽基因，并進行了表達、純化與活性研究。E.coli AKP作為工具酶在表位連鎖、組織化學、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應用。目前市場上常見的AKP產(chǎn)品有蝦堿性磷酸酶（SAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，約為天然E.coli AKP的40倍[3]。與天然提純的SAP和CIAP相比，E.coli AKP的生產(chǎn)成本低，熱穩(wěn)定性好。由于AKP的構(gòu)效關(guān)系明確，且在定點誘變和結(jié)構(gòu)改造方面積累了一定的經(jīng)驗[4-5]。進一步研究可結(jié)合計算機模擬對E.coli AKP的三維結(jié)構(gòu)與催化活性之間的關(guān)系進行深入分析[6]，利用當前蛋白質(zhì)工程的先進技術(shù)手段對重組E.coli AKP進一步改構(gòu)。

[1]Coleman JE,Gettins P.Alkaline phosphatase,solution structure,and mechanism[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1983,55:381-452.

[2]Coleman JE.Structure and mechanism of alkaline phosphatase[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,1992,9(21):441-483.

[3]Wanner BL.Overlapping and separate control on the phosphateregulation in E.coli K12[J].J Mol Biol,1983,166:283-308.

[4]MullerBH,LamoureC,LeD.ImprovingEscherichiacolialkalinephosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket[J].Chembiochem,2001,(2):517-523.

[5]王秋穎,李寧,向本瓊.大腸桿菌堿性磷酸酶突變體的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)與功能研究[J].北京師范大學學報:自然科學版,2007,43(6):647-652.

[6]Lopez-CanutV,RocaM,BertranJ,etal.Promiscuityinalkalinephosphatase superfamily,unraveling evolution through molecular simulations [J].J Am Chem Soc,2011,133(31):12050-12062.

Study on cloning,expression and activity of alkaline phosphatase from Escherichia coli DH10B

LI Jun1,2,HUANG Xia2,YAO Xuemei2,CHEN Xuefen2,QI Xingzhu2
1.Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education,Hainan Province,Haikou 570228,China;2.Ocean College of Hainan University,Hainan Province,Haikou 570228,China

Objective:To clone and express alkaline phosphatase mature peptide gene of E.coli DH10B for the foundation of directed structural transformation and application of AKP.Methods:phoAm gene was amplified from E.coli DH10B genome by PCR;phoAm gene was cloned into pET28a and transformed into E.coli BL21(DE3);rAKP was detected by immuno-gold chromatography and SDS-PAGE;the activity of rAKP was determined by pNPP method.Results:Molecular weight of rAKP monomer was about 47 K,and activity of rAKP increased 21.5 times compared with the control.Conclusion:AKP matural peptide gene and rAKP with higher activity is acquired.

Alkaline phosphatase;E.coli DH10B;Express and purify;Activity analysis

Q78

A

1673-7210（2012）01（a）-028-03

海南大學211工程研究生教育教學改革研究項目（項目編號：YJG0102）。

李軍（1969-），男，博士，副教授，碩士研究生導師；研究方向：生物制藥與藥物制劑。

2011-08-08）