馮芳，趙偉，孫姍姍

(山東福洋生物科技有限公司，山東德州，253100)

葡萄糖酸及其鹽類廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、建筑等行業(yè)，其中葡萄糖酸鈣是白色晶體或粉末，不僅能夠預(yù)防鈣缺乏癥，促進(jìn)牙齒和骨骼發(fā)育，還可治療血鈣含量過低引起的抽搐和鎂中毒等疾病。作為營養(yǎng)藥物，葡萄糖酸鈣具有易溶解和吸收的特性，靜脈注射或口服皆可，因此在臨床中用途廣泛［1－3］。

葡萄糖酸鈣的制備普遍采用生物發(fā)酵法［4］，一般以黑曲霉作為生產(chǎn)菌種。葡萄糖酸鈣用途廣，市場(chǎng)需求量大，篩選高產(chǎn)菌種是提高其產(chǎn)量的關(guān)鍵。高通量篩選技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的目的菌種選育的新技術(shù)，具有微型、高效和低成本等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于菌種選育［5－7］。本文以經(jīng)紫外線-LiCl復(fù)合誘變處理的黑曲霉為研究對(duì)象，建立高通量篩選葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌種的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

實(shí)驗(yàn)原始菌種為黑曲霉，來自山東福洋生物科技有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):C6H12O6·H2O 264.0 g，CO(NH2)20.2 g，KH2PO40.64 g，玉米漿 7.2 g，CaCO310.0 g，pH 6.5 ～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):C6H12O6·H2O 330.0 g，CO(NH2)20.1 g，KH2PO40.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，玉米漿1.0 g，CaCO338.0 g，pH 6.5 ～7.0。

上述培養(yǎng)基均于115℃，滅菌30 min。

斜面培養(yǎng)基(g/L):C6H12O6·H2O 66.0 g，CO(NH2)20.2 g，KH2PO40.13 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，玉米漿1.0 g，CaCO35.0 g，瓊脂20.0 g，pH 6.5 ～7.0。

培養(yǎng)基于121℃，滅菌20 min。

1.3 主要與儀器

DHZ-D大容量恒溫振蕩器，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;MJX-160C型霉菌培養(yǎng)箱和YXOQ-LS-75S11立式蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SWCJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;TDZ5-WS平板離心機(jī)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀，美國芬蘭雷勃有限公司;LC-WS100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.4 相關(guān)參數(shù)測(cè)定方法

1.4.1 致死率的計(jì)算

1.4.2 葡萄糖酸鈣的測(cè)定方法

1.4.2.1 酶標(biāo)板分光光度法

孔板發(fā)酵中葡萄糖酸鈣含量的測(cè)定采用簡化的分光光度法。葡萄糖酸根可以絡(luò)合Cu2+形成藍(lán)綠色的絡(luò)合物，這種絡(luò)合物在690 nm下有吸收，并且在一定范圍內(nèi)吸光值和葡萄糖酸根離子的濃度呈線性關(guān)系。

1.4.2.2 高效液相色譜法

色譜柱:Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:V(甲醇)∶V(磷酸)=1∶10(其中磷酸的體積分?jǐn)?shù)為1%);進(jìn)樣體積20 μL;檢測(cè)波長210 nm;流速1 mL/min;柱溫25℃。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1 黑曲霉孢子懸浮液的制備

加10mL生理鹽水，將斜面孢子洗下，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的三角瓶中，38℃，150 r/min搖床中振蕩30 min后，顯微鏡計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL，備用。

1.5.2 紫外誘變

將5 mL孢子懸液移入直徑6 cm無菌平皿，于15 W 的紫外燈，距離約 30 cm 照射 1、2、3、4、5 min，暗光條件下，梯度稀釋，吸取處理后的孢子懸浮液0.1 mL涂布平板，避光于霉菌培養(yǎng)箱38℃，培養(yǎng)3 d至長出成熟菌落，統(tǒng)計(jì)致死率，觀察菌落形態(tài)。

1.5.3 紫外線-LiCl復(fù)合誘變

將5 mL孢子懸液倒入直徑6 cm無菌平皿于15 W的紫外燈，距離約30 cm處照射2 min，加入不同濃度LiCl溶液0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，靜置處理20～30 min，其他操作同1.5.2。

1.5.4 孔板培養(yǎng)

種子孔板和發(fā)酵均為48孔板，即A、B、……H×1、2、……6。種子孔板裝液量為100 μL，孔 A1和 C4接入一定體積未誘變的孢子懸浮液，為對(duì)照孔，其余孔板接入處理后等體積的孢子懸浮液，于38℃，300 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)16 h。發(fā)酵孔板接裝液量為700 μL，接種量為 10%，于 38℃，300 r/min 振蕩培養(yǎng)36 h。利用酶標(biāo)儀測(cè)定葡萄糖酸鈣含量。

1.5.5 高通量檢測(cè)流程

將發(fā)酵孔板于孔板離心機(jī)中3 000 r/min，離心30 min;取上清液50 μL加入空白孔板中，依次加入400 μL 0.1 mol/L CuSO4，550 μL 去離子水，于150 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩10 min后，沸水浴5 min，冰水迅速冷卻至室溫。

每孔移取取200 μL加入酶標(biāo)板中，于 Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀中，檢測(cè)其690 nm下的吸光值，計(jì)算葡萄糖酸鈣含量。

1.5.6 搖瓶培養(yǎng)

由高通量篩選得到的葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌種，為了保證其發(fā)酵穩(wěn)定性，將其連續(xù)傳代4次，每次傳代后接入發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣含量。

種子搖瓶裝液量25 mL，38℃，300 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h;發(fā)酵搖瓶裝液量50 mL，接種量10%，38℃，300 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)36 h左右。高效液相法測(cè)定發(fā)酵中的葡萄糖酸鈣含量，作為參考指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌株復(fù)合誘變條件的確定

2.1.1 紫外線最佳照射時(shí)間的選擇

物理誘變劑有快中子、60Co、γ射線。高能電子流β射線和紫外線等，其中作用最普遍的是紫外線輻照［8］。微生物在經(jīng)紫外線照射后，受到不同程度的損傷，從而導(dǎo)致DNA分子或染色體發(fā)生畸變，最終導(dǎo)致生物性狀發(fā)生突變［9］。

從圖1可以看出，隨著紫外線照射時(shí)間的延長，孢子的致死率逐漸升高，輻照時(shí)間為5 min時(shí)，致死率已達(dá)到98%，接近100%。根據(jù)現(xiàn)代誘變育種理論，生產(chǎn)中性能穩(wěn)定的菌株誘變致死率為70%～80%時(shí)，更易篩選得正突變率高的菌株［10］，因此紫外線最適照射時(shí)間為2 min。

圖1 紫外線照射時(shí)間對(duì)孢子致死率的影響

2.1.2 LiCl誘變致死率及結(jié)果

葡萄糖酸鈣是葡萄糖酸與碳酸鈣中和反應(yīng)生成的，而葡萄糖酸是黑曲霉的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，它的合成過程復(fù)雜［11］。常規(guī)單一誘變處理不易得到高產(chǎn)菌株，復(fù)合誘變具有協(xié)同效應(yīng)，比單因子誘變效果好，同時(shí)還可解除單因子誘變產(chǎn)生的“疲勞效應(yīng)”［12－13］。

將孢子懸浮液于15 W的紫外燈距離約30 cm處照射 2 min 后，0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%LiCl溶液靜置處理20～30 min，平板涂布，LiCl溶液濃度與孢子誘變致死率的關(guān)系如圖2所示，菌落形態(tài)特征如表1所示。

圖2 LiCl溶液濃度對(duì)孢子致死率的影響

從圖2可以看出，隨著LiCl溶液濃度的升高，孢子的致死率呈上升趨勢(shì)，根據(jù)誘變致死率70%～80%，誘變菌株的正突變率高的特性，LiCl溶液濃度為1%～1.5%較為適宜。

表1 LiCl誘變菌種的菌落形態(tài)特征結(jié)果

由表1可知，LiCl溶液濃度過低，誘變致死率低，誘變孢子懸浮液平板涂布生成的菌落過多，不易篩選單菌落;LiCl溶液濃度過高，孢子致死率接近100%。

根據(jù)菌落形態(tài)特征和誘變致死率的適宜范圍，LiCl溶液濃度選為1.5%時(shí)，誘變致死率為80%，單菌落的透明圈較大，孢子黑且大，生長旺盛。

2.2 高產(chǎn)葡萄糖酸鈣黑曲霉菌株的高通量篩選

2.2.1 孔板發(fā)酵安全性能驗(yàn)證

在同一孔板的發(fā)酵培養(yǎng)基中，交替接入相當(dāng)于培養(yǎng)基體積10%黑曲霉的孢子懸液，在38℃下，轉(zhuǎn)速300 r/min，培養(yǎng)40 h之后，吸取未接入孢子懸液的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行涂布，平板并未有黑曲霉菌落生成。檢測(cè)結(jié)果說明接種孔相鄰的空白孔無染菌污染現(xiàn)象，證明48孔板孔洞之間不存在交叉污染。

2.2.2 孔板與搖瓶發(fā)酵性能對(duì)比

按相同接種量接入孢子懸液于種子孔板和搖瓶中，在 38℃下，轉(zhuǎn)速 300 r/min，培養(yǎng) 24h之后，以10%的接種量將孔板和搖瓶的種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵孔板和搖瓶中，在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)，48孔板與搖瓶發(fā)酵趨勢(shì)對(duì)比關(guān)系如圖3所示。

圖3 48孔板與搖瓶發(fā)酵趨勢(shì)對(duì)比關(guān)系

根據(jù)圖3，在40 h左右，48孔板與搖瓶的發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣的含量不再升高，發(fā)酵基本結(jié)束。發(fā)酵初期，搖瓶的發(fā)酵速率較快，而30 h之后，48孔板發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣含量明顯高于搖瓶，因?yàn)楹谇故呛醚跷⑸铮S著不斷代謝生成葡萄糖酸鈣，對(duì)溶氧要求高，48孔板的通氧量要優(yōu)于搖瓶，更適合菌株發(fā)酵［15］。

結(jié)果證明，搖瓶發(fā)酵與孔板微型化發(fā)酵有良好的相關(guān)性，即孔板微型化發(fā)酵有一定可行性，可以用孔板代替搖瓶驗(yàn)證初篩菌種的發(fā)酵性能。

2.2.3 高產(chǎn)葡萄糖酸鈣菌株的初步確定

將經(jīng)紫外線-LiCl復(fù)合誘變處理的孢子懸浮液轉(zhuǎn)入48孔板進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定法發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣的含量，如表2所示，從12個(gè)48孔板中共篩選得到11個(gè)高產(chǎn)孔，發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣含量最高達(dá)到24.07 g/100 mL，比普通菌種高6.83 g/100 mL。

表2 葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌株的篩選結(jié)果

2.3 高產(chǎn)葡萄糖酸鈣菌株搖瓶復(fù)篩

將高通量篩選確定的葡萄糖酸鈣高產(chǎn)孔的種子液進(jìn)行平板涂布，挑單菌落劃斜面，共得到48支斜面，經(jīng)搖瓶復(fù)篩確定其中9支為高產(chǎn)菌株，傳代后進(jìn)一步檢測(cè)其穩(wěn)定性，其篩選結(jié)果如表3所示。

表3 高產(chǎn)葡萄糖酸鈣菌株復(fù)篩結(jié)果

根據(jù)表3，菌株 P-2、P-9、P-26、P-27與未經(jīng)誘變處理的原始菌種對(duì)比，斜面長勢(shì)良好、產(chǎn)孢豐富，進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，生成的葡萄糖酸鈣含量高，產(chǎn)代后發(fā)酵性能穩(wěn)定。而其余5株菌株傳代后，均出現(xiàn)不同程度的發(fā)酵性能退化現(xiàn)象。

由于UV-LiCl復(fù)合誘變處理得到的高產(chǎn)菌株，變異的方向和性質(zhì)難控制，易突變反復(fù)，需通過傳代檢測(cè)其發(fā)酵性能穩(wěn)定性。得到的4支葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌株，特別是菌株P(guān)-9，發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣含量最高達(dá)到23.04 g/100mL，與原始菌種對(duì)比，葡萄糖酸鈣含量提高30%左右，效果明顯。

3 結(jié)論

經(jīng)紫外線-LiCl復(fù)合誘變處理的孢子懸浮液，轉(zhuǎn)入48孔板進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，通過高通量篩選得到4株葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌株，將其連續(xù)傳代4次，發(fā)酵性能穩(wěn)定，特別是菌株P(guān)-9，發(fā)酵液中葡萄糖酸鈣含量高達(dá)23.04g/100mL，與原始菌種相比，產(chǎn)量明顯提高30%。

篩選得到葡萄糖酸鈣高產(chǎn)菌株只是初步驗(yàn)證了其發(fā)酵穩(wěn)定性，需要發(fā)酵中試進(jìn)一步驗(yàn)證和優(yōu)化，從而應(yīng)用于車間生產(chǎn)。

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