張偉，李文，趙繼東，林燕，彭兆城，王欣澤

1(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海，200240)2(長(zhǎng)安大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安，710064)3(大理州環(huán)境保護(hù)局，云南大理，671000)

生物質(zhì)燃料，作為一種能夠替代傳統(tǒng)化石燃料的新興能源，越來越受到世界各國的重視［1］。其中，燃料乙醇作為一種環(huán)境友好型的生物質(zhì)燃料，具有燃燒值較高，燃燒后的產(chǎn)物主要為水和二氧化碳，無其他有害氣體，所以更受青睞。相對(duì)于美國和巴西以玉米和甘蔗為主要原料的燃料乙醇生產(chǎn)方式反而可能導(dǎo)致的CO2排放量增加問題［2］(達(dá)到生物質(zhì)燃料溫室氣體總削減量的17～420倍［3］)，利用農(nóng)業(yè)廢棄物，如秸稈類木質(zhì)纖維素原料來生產(chǎn)生物質(zhì)燃料，能快速、持續(xù)降低溫室氣體的排放，溫室氣體排放量減少達(dá)86%［4］，且能避免與人爭(zhēng)糧的問題，具有廣闊的應(yīng)用前景。

利用秸稈類木質(zhì)纖維素來生產(chǎn)燃料乙醇主要包括以下3個(gè)步驟:預(yù)處理、纖維素酶水解、乙醇發(fā)酵［5］。同步糖化發(fā)酵(SSF)是將纖維素酶水解過程和乙醇發(fā)酵過程整合在一個(gè)反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行，具有乙醇產(chǎn)率較高，反應(yīng)速率較快，可降低產(chǎn)物(糖)對(duì)纖維素酶活性的抑制作用，且由于反應(yīng)在同一反應(yīng)器中進(jìn)行，具有前期投資成本及運(yùn)行費(fèi)用較低等優(yōu)點(diǎn)。盡管如此，此技術(shù)目前尚存在一些難題，如通常釀酒酵母的最佳溫度為30～35℃，而纖維素酶水解的最佳溫度為45～50℃［6］，反應(yīng)過程中秸稈的固體含量較低，難以提高等問題［7］。

目前提高秸稈SSF過程中乙醇發(fā)酵效率主要是利用耐高溫酵母或通過溫度變化，采用非等溫發(fā)酵等來實(shí)現(xiàn)。Pessani等人以經(jīng)過熱水預(yù)處理的柳枝為原料，初始固體含量為8.0%(m/V)，利用篩選出的耐熱Kluyveromyces maxianus IMB3，在45℃同步糖化發(fā)酵168 h后，乙醇濃度達(dá)最大值，為22.5g/L［8］。Kang等人以經(jīng)過氨纖維爆破的大麥秸稈為原料，初始固體含量為16%(m/V)，利用耐熱Kluyveromyces maxianus CHY1612，通過變化發(fā)酵溫度:45℃發(fā)酵24 h，35℃發(fā)酵48 h，最終乙醇濃度可達(dá)34.3 g/L，較45℃發(fā)酵 72 h 提高了 12.1 g/L［5］。

以上研究考慮了溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵的影響，利用酵母對(duì)高溫的耐受性，從而提高乙醇濃度和產(chǎn)率。然而，秸稈同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的過程非常復(fù)雜，影響因素也較多，僅從溫度方面進(jìn)行研究和考察，效果還很有限。本文以小麥秸稈為原料，在已實(shí)現(xiàn)耐高溫發(fā)酵性能的發(fā)酵系統(tǒng)中，系統(tǒng)研究并考察了溫度、固體含量、纖維素酶投加量、酵母菌濃度，對(duì)最終SSF系統(tǒng)乙醇濃度及產(chǎn)率的影響，達(dá)到了纖維素酶水解和酵母發(fā)酵溫度的協(xié)調(diào)，使得同步糖化發(fā)酵過程在高溫、高固體含量的條件下仍能保持較高的乙醇產(chǎn)率，提高了原料的利用效率，縮短了反應(yīng)所需的時(shí)間，同時(shí)也可降低后續(xù)乙醇蒸餾的成本。

1 材料與方法

1.1 材料與酶制劑

小麥秸稈:取自太湖周邊農(nóng)村，經(jīng)1.0%NaOH預(yù)處理、105℃烘干、粉碎、過80目篩，待用。

預(yù)處理后的小麥秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量如表1所示。

表1 NaOH預(yù)處理小麥秸稈成分

纖維素酶:ATCC26921，購自Sigma公司，酶活性為82.22 FPU/mL。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

釀酒酵母:S.cerevisiae BY4742，本實(shí)驗(yàn)室馴化后得到的耐高溫高產(chǎn)菌株。

液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，121℃滅菌30 min。

1.3 酵母菌復(fù)活及擴(kuò)培方法

1.3.1 酵母菌復(fù)蘇

取保存于－80℃的釀酒酵母S.cerevisiae BY4742，于37℃恒溫180 r/min振蕩培養(yǎng)14～18 h，然后將培養(yǎng)后菌體混合液在4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，加200 mL無菌水，混勻，離心，直至上清液澄清。

1.3.2 酵母菌擴(kuò)培

在離心過后的菌體中加入50 mL無菌水，混勻，分別取0.5 mL接種于8個(gè)裝有250 mL培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37℃搖床恒溫180 r/min振蕩培養(yǎng)14～16 h。擴(kuò)培的酵母菌在4 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，加200 mL無菌水，混勻，離心，直至上清液澄清。

1.4 秸稈同步糖化發(fā)酵操作

小麥秸稈同步糖化發(fā)酵過程中的影響因子及其水平設(shè)計(jì)如表2所示。所有同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)平行樣，每個(gè)樣品總有效體積為10 mL，并通過檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液控制pH為4.0，總發(fā)酵時(shí)間為120 h，每24 h取樣，4 000 r/min離心10 min，取上清液，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后于2 mL棕色樣品瓶中4℃保存。

1.5 分析方法

1.5.1 成分分析方法

預(yù)處理小麥秸稈中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素含量的測(cè)定根據(jù)NREL標(biāo)準(zhǔn)方法［9］進(jìn)行。

1.5.2 濾紙纖維素酶活測(cè)定

Sigma纖維素酶的濾紙纖維素酶活的測(cè)定根據(jù)IUPAC標(biāo)準(zhǔn)方法［10］。濾紙纖維素酶活力的單位為FPU/mL，1FPU定義為1min內(nèi)，纖維素酶水解Whatman No.1濾紙所產(chǎn)生的葡萄糖量［11］。

1.5.3 還原糖和乙醇的測(cè)定

葡萄糖、木糖、乙醇濃度通過高效液相色譜(Shimadzu 10－AD，Kyoto，Japan)進(jìn)行定量分析，檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器(RID－10A，Shimadzu，Kyoto，Japan)。色譜柱使用 Aminex HPX－87P column(Bio－Rad，USA)，并帶有保護(hù)柱。柱溫為65℃，檢測(cè)器溫度為40℃，流動(dòng)相為超純水，流速為0.8 mL/min，注射體積為 20 μL。

1.5.4 計(jì)算公式

纖維素水解產(chǎn)生葡萄糖的化學(xué)方程式如公式(1)所示，理論上，100 g纖維素可產(chǎn)生111.1 g葡萄糖。葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的化學(xué)方程式如公式(2)所示。理論上，100 g葡萄糖產(chǎn)生51.1 g乙醇和48.9 g CO2。則100 g纖維素理論上產(chǎn)生56.8 g乙醇。預(yù)處理小麥秸稈中纖維素含量為58.84%，則100 g預(yù)處理小麥秸稈理論上最多能產(chǎn)生33.4 g乙醇。

本研究中定義乙醇產(chǎn)率(Y)為同步糖化發(fā)酵過程中，每克預(yù)處理小麥秸稈產(chǎn)生的乙醇量與理論產(chǎn)量的比值，如公式(3)所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)秸稈同步糖化發(fā)酵的影響

溫度是同步糖化發(fā)酵最為重要的一個(gè)影響因素，纖維素酶和酵母菌最佳反應(yīng)溫度之間的差異也是影響同步糖化發(fā)酵應(yīng)用最為重要的一個(gè)方面。圖1為溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度和產(chǎn)率的影響，其中，溫度設(shè)置為 35，37，38，40，42℃五個(gè)水平，所有樣品均取自NaOH預(yù)處理小麥同步糖化發(fā)酵120 h后的發(fā)酵液。從圖1可以看出，在35～38℃，隨著溫度的上升，乙醇濃度、產(chǎn)率逐步增加，但趨勢(shì)逐漸減緩。38℃時(shí)乙醇產(chǎn)率達(dá)到最大值，為61.08%。溫度的升高增強(qiáng)了纖維素酶活性，促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)行;同時(shí)，酶解產(chǎn)生的葡萄糖能為酵母菌迅速利用，一方面減輕了葡萄糖對(duì)纖維素酶活性的反饋抑制，促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行［12］;另一方面，在釀酒酵母的耐受溫度范圍內(nèi)，溫度的提高能增強(qiáng)細(xì)胞中酶活性及維持細(xì)胞膜的高滲透性，有利于營(yíng)養(yǎng)物的進(jìn)入和乙醇、CO2的排出［13］，從而提高了乙醇的濃度和產(chǎn)率。但隨著溫度的進(jìn)一步升高，酵母菌的活性受到較大程度的抑制［14］，超過耐受溫度時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速率下降，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白、RNA、DNA及游離氨基酸都減少，同時(shí)，高溫也會(huì)使細(xì)胞膜流動(dòng)性下降，溶質(zhì)和必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以進(jìn)入細(xì)胞膜，使酵母呼吸活性明顯下降，乙醇產(chǎn)率反而出現(xiàn)下降。Laluce等人利用基因改造S.cerevisiae 63M，優(yōu)化同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，固定原料濃度為100 g/L，發(fā)酵溫度為30～40℃，乙醇產(chǎn)率呈現(xiàn)先增高后減少的趨勢(shì)［15］。在本研究中，秸稈同步糖化發(fā)酵的最佳溫度為38℃，可實(shí)現(xiàn)61.08%的發(fā)酵效率。

圖1 溫度對(duì)同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度和乙醇產(chǎn)率的影響

2.2 固體含量對(duì)秸稈同步糖化發(fā)酵的影響

利用秸稈類木質(zhì)纖維素原料同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，為了降低后續(xù)乙醇蒸餾回收成本，應(yīng)盡可能提高發(fā)酵液中乙醇濃度，即應(yīng)盡可能提高同步發(fā)酵過程中底物的固體含量［16］。圖2為不同秸稈固體含量下同步糖化發(fā)酵120h后發(fā)酵液中乙醇濃度和產(chǎn)率。研究發(fā)現(xiàn)，固體含量的增加有助于提高乙醇濃度，固體含量為16%(w/v)時(shí)乙醇濃度達(dá)最大值，為29.06g/L，產(chǎn)率為54.38%。固體含量繼續(xù)增加到20%(w/v)時(shí)，發(fā)酵液中乙醇濃度停止增加，并出現(xiàn)了下降。乙醇產(chǎn)率隨著固體含量的增加而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)。固體含量的提高增加了混勻難度，不利于纖維素酶與秸稈的充分接觸;同時(shí)低水分的環(huán)境也不利于酵母菌的生長(zhǎng)和代謝，從而降低了乙醇產(chǎn)率。

圖2 固體含量對(duì)同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度和產(chǎn)率的影響

有報(bào)道稱，一個(gè)經(jīng)濟(jì)的同步糖化發(fā)酵工藝需要秸稈固體含量大于 15%(m/V)［17］。Tomás－Pejó等人研究了固體含量對(duì)同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度的影響，初始固體含量設(shè)置為10%(m/V)，同步糖化發(fā)酵12 h后，添加4%(m/V)底物，最終乙醇濃度達(dá)最大值，為 36.2 g/L［18］。

本研究中，秸稈固體含量為16%(m/V)時(shí)，最終乙醇濃度比固體含量為2%(m/V)時(shí)提高了24.97 g/L，且乙醇產(chǎn)率只下降了6.85%，因此，選取秸稈固體含量16%(m/V)為本研究中最佳的固體含量。

2.3 纖維素酶投加量對(duì)秸稈同步糖化發(fā)酵的影響

同步糖化發(fā)酵過程中，固體含量一定時(shí)，纖維素酶投加量越高，越有利于底物的轉(zhuǎn)化，但是纖維素酶投加量的增大無疑將增大生產(chǎn)的成本［19］。因此，有必要研究纖維素酶投加量對(duì)秸稈同步發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著纖維素酶投加量的增加，乙醇濃度和產(chǎn)率均得到了提高。乙醇濃度和產(chǎn)率在纖維素酶投加量為35 FPU/g底物時(shí)基本達(dá)到最大值，為32.44 g/L和60.70%。

圖3 纖維素酶投加量對(duì)同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度和產(chǎn)率的影響

Zhao等人利用重組S.cerevisiae ZU－10以經(jīng)過堿預(yù)處理過的玉米秸稈為底物，初始濃度為80 g/L，纖維素酶投加量為20 FPU/g底物，在33℃下進(jìn)行同步糖化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過72 h后，乙醇濃度達(dá)到27.8 g/L［20］。本研究中，纖維素酶投加量為35 FPU/g秸稈時(shí)，秸稈中纖維素的有效部位已經(jīng)被纖維素酶充分吸附，纖維素酶只有吸附于纖維素，水解反應(yīng)才能進(jìn)行。纖維素酶投加量為50 FPU/g秸稈時(shí)，多余的纖維素酶游離于混合體系中，無助于提高秸稈的水解效率，乙醇濃度和產(chǎn)率基本不變，只比35 FPU/g底物時(shí)增加了0.35 g/L和0.66%，故選取35 FPU/g底物作為最佳的纖維素酶投加量。

2.4 酵母菌濃度對(duì)秸稈同步糖化發(fā)酵的影響

酵母菌濃度對(duì)秸稈同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度和產(chǎn)率的影響如圖4所示。結(jié)果表明，酵母菌濃度的增加總體上有利于乙醇濃度和產(chǎn)率的提高，這是由于隨著初始酵母菌濃度的增加，有利于將纖維素酶水解產(chǎn)生的葡萄糖快速發(fā)酵轉(zhuǎn)化成乙醇，減少了由于葡萄糖的積累對(duì)纖維素酶的毒害作用，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。

圖4 酵母菌濃度對(duì)同步糖化發(fā)酵過程中乙醇濃度和產(chǎn)率的影響

本研究中，當(dāng)酵母菌濃度為8 g/L時(shí)，乙醇濃度和產(chǎn)率達(dá)到最大值，為38.32 g/L和71.71%。當(dāng)初始酵母菌濃度增加到10 g/L時(shí)，由于生物量太大，而酶解產(chǎn)生的葡萄糖有限，不能維持酵母菌正常的生成和代謝，乙醇濃度和產(chǎn)率均開始下降。適宜的酵母菌濃度能縮短同步發(fā)酵周期，提高乙醇產(chǎn)率。本研究中選取8 g/L為酵母菌濃度。

2.5 時(shí)間對(duì)秸稈同步糖化發(fā)酵的影響

圖5為時(shí)間對(duì)同步糖化發(fā)酵過程的影響?？梢钥闯?，NaOH預(yù)處理過的小麥秸稈同步糖化發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中的乙醇濃度即可達(dá)到30.02 g/L，產(chǎn)率為56.18%。木糖濃度在24 h后基本已達(dá)最大值，為13.34 g/L。延長(zhǎng)同步糖化發(fā)酵時(shí)間，乙醇濃度逐漸增加，但變化趨勢(shì)相對(duì)緩慢，120h時(shí)乙醇濃度達(dá)38.32 g/L，產(chǎn)率達(dá) 71.71%，較 24h時(shí)提高了15.53%，此時(shí)木糖濃度為12.94 g/L。0～24 h乙醇平均生產(chǎn)率達(dá)1.25 g/(L·h)，0～120 h乙醇平均生產(chǎn)率則下降為0.32 g/(L·h)。

時(shí)間的延長(zhǎng)有利于乙醇濃度和產(chǎn)率的增加，但平均發(fā)酵速率卻逐漸減小。這是由于0～24 h由于纖維素酶對(duì)秸稈中纖維素的快速吸附水解，產(chǎn)生的葡萄糖為酵母菌快速發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，使得乙醇濃度較快增加。之后，一方面由于隨著可供水解底物的減少，產(chǎn)生的乙醇對(duì)纖維素酶活性的抑制以及纖維素酶的脫附等因素，水解速率減緩，同時(shí)，隨著發(fā)酵液中乙醇濃度的增加，乙醇對(duì)酵母菌毒性增大，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得松散，細(xì)胞呼吸、生長(zhǎng)受到抑制，甚至不再增長(zhǎng)，發(fā)酵能力削弱;另一方面，由于酵母菌自身的增殖，需消耗較多營(yíng)養(yǎng)維持自身正常生長(zhǎng)，從而降低了乙醇平均產(chǎn)率。

圖5 最優(yōu)同步糖化發(fā)酵條件下葡萄糖、木糖、乙醇濃度、產(chǎn)率隨時(shí)間的變化

本實(shí)驗(yàn)中，考慮到120 h時(shí)乙醇濃度、產(chǎn)率和對(duì)原料的利用效率均較高，故選取120 h為小麥秸稈同步糖化發(fā)酵時(shí)間。

3 結(jié)論

利用S.cerevisiae BY4742同步糖化發(fā)酵NaOH預(yù)處理小麥秸稈制取燃料乙醇，通過考察溫度、固體含量、纖維素酶投加量以及酵母菌濃度對(duì)其發(fā)酵性能的影響，得出同步糖化發(fā)酵最優(yōu)條件為:發(fā)酵溫度38℃，固體含量16%(m/V)，纖維素酶投加量35 FPU/g底物，酵母菌濃度8 g/L。在此條件下，經(jīng)過120 h同步糖化發(fā)酵后，乙醇濃度達(dá)到最大值，為38.32 g/L，產(chǎn)率達(dá)理論產(chǎn)率的71.71%，乙醇平均生產(chǎn)率為0.32 g/(L·h)，此時(shí)木糖濃度為12.94 g/L。

通過此項(xiàng)研究，使得纖維素酶最佳水解溫度和酵母菌發(fā)酵溫度得到了很好的耦合，且使發(fā)酵過程中底物固體含量得到了較大程度的提高，達(dá)16%(m/V)，大大提高了乙醇濃度和原料的利用效率，還可降低后續(xù)蒸餾的成本，促進(jìn)了利用農(nóng)業(yè)廢棄物秸稈制取燃料乙醇的工業(yè)化進(jìn)程。

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