羅愛華 黃小敏 曾湖 李雄

細(xì)胞間隙連接是普遍存在于組織中的一種細(xì)胞連接形式，通過Cx介導(dǎo)的細(xì)胞間連接通訊，對細(xì)胞的增殖、分化進(jìn)行調(diào)控。間隙連接由相鄰細(xì)胞膜上的連接子相互銜接而成，連接子的蛋白質(zhì)亞單位即間隙連接蛋白。間隙連接功能缺陷可能是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。研究Cx32在正常肝中的表達(dá)，進(jìn)一步探討與肝細(xì)胞性肝癌發(fā)生的關(guān)系［1］。采用免疫組織化學(xué)探討NF-κB和間隙連接蛋白Cx32在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)特征。分析其表達(dá)與肝癌臨床病理特點之間的關(guān)系，檢測NF-κB與Cx32表達(dá)水平有助于判斷肝癌惡性程度和預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料 收集我科2007～2010年間肝細(xì)胞癌手術(shù)標(biāo)本48例，平均年齡45.4歲，正常肝組織為肝膽管結(jié)石切除肝組織12例。根據(jù)2000年WHO消化道腫瘤肝癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類。肝細(xì)胞癌分為4級，Ⅰ級2例，Ⅱ級32例，Ⅲ級8例，Ⅳ級6例。

1.2 免疫組化染色和判斷標(biāo)準(zhǔn) 送檢標(biāo)本取材制片，切片脫蠟至水，高溫高壓法5 mi抗原修復(fù)。修復(fù)后阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS作為陽陰性對照，PBS水洗后加一抗，4℃孵育過夜，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。SP試劑盒為上海太陽生物公司產(chǎn)品。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):采用半定量法評估組織免疫組反應(yīng)強度和陽性細(xì)胞率。細(xì)胞核和/(或)胞漿著色最深為3分，無色為0分，兩者之間為1或2分。每張切片選擇10個典型視野，將免疫反應(yīng)的平均強度視為此例的免疫反應(yīng)強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，分別采用多因素方差(MANOVA)分析、Kruskal-Wallis H檢驗和Nemenyi檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 Cx32蛋白在HCC及正常肝中陽性率

2 結(jié)果

2.1 Cx32蛋白的表達(dá) 分別檢測每例標(biāo)本Cx32蛋白的表達(dá)，陽性染色表達(dá)定位于胞漿和胞膜上，肝硬化組織中胞漿陽性為主88.91%(11/12)，反應(yīng)強度高。Cx32在HCC組織中有不同程度的表達(dá)。HCC陽性細(xì)胞以胞漿內(nèi)彌漫、均勻分布為主，也可見胞膜陽性，染色較淡。經(jīng)χ2檢驗，Cx32在HCC中陽性率明顯低于其在肝正常組織的陽性率(P＜0.01)，隨著HCC分化程度降低，其陽性率有所下降，比較結(jié)果見表1。

2.2 NF-κB蛋白的表達(dá) 陽性染色表達(dá)定位于胞核，本研究結(jié)果顯示，NF-κB在正常肝組織及HCC組織中表達(dá)分別為21.34%(3/12)，71.28%(34/48)(P ＜0.01)。同時 NF-κB 在高中低分化HCC組織中的表達(dá)率有顯著差異(P＜0.05)并與臨床TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)，表明肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與NF-κB的高表達(dá)有顯著相關(guān)性，提示NF-κB活化后，進(jìn)入胞核，通過抑制細(xì)胞的調(diào)亡從而調(diào)控腫瘤的生長，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝癌的發(fā)生。

3 討論

細(xì)胞間隙連接是相鄰細(xì)胞之間形成的一種能夠開放和關(guān)閉的親水性膜通道結(jié)構(gòu)，由跨膜的細(xì)胞間隙連接蛋白(connexin，Cx)構(gòu)成，只能透過相對分子質(zhì)量通道的直徑約為1.5～2.0＜1000的分子和離子，如Ca2+、cAMP、三磷酸肌醇、葡萄糖、維生素及其他參與生長調(diào)節(jié)的物質(zhì)可以通過間隙連接為相鄰細(xì)胞所共有，而蛋白質(zhì)、RNA、多糖和脂質(zhì)復(fù)合物等大分子物質(zhì)則不能透過間隙連接通道，不同組織、細(xì)胞之間通過間隙連接，進(jìn)行信息溝通，平均代謝產(chǎn)物，使各種信息有效的達(dá)到相應(yīng)的細(xì)胞，保持細(xì)胞群體對生長刺激和調(diào)節(jié)反應(yīng)的同步性，使細(xì)胞的增值、分化按正常的程序進(jìn)行［2-4］。Mesnil M［5］研究表明，用Cx基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，使其重建細(xì)胞間隙連接，恢復(fù)GJIC可以延緩腫瘤細(xì)胞生長。在Warn-Cramer［6］的實驗中，Martyn將CxcDNA轉(zhuǎn)染至小鼠永生化細(xì)胞后，并為建立功能性細(xì)胞間隙連接通訊，但仍然抑制細(xì)胞增殖。本研究表明，Cx32在肝細(xì)胞及HCC細(xì)胞中均存在不同程度的表達(dá)，既定位于胞漿內(nèi)，又有胞膜陽性，或二者同時陽性，與國外文獻(xiàn)報道相符合。研究發(fā)現(xiàn)，Cx32在正常肝細(xì)胞中有較高水平的表達(dá)(88.91%)，陽性細(xì)胞深染。在HCC組織低表達(dá)(37.50%)，且染色強度明顯減弱。Cx32的表達(dá)減弱與正常肝、至HCC的惡性進(jìn)程密切相關(guān)。

研究同時對Cx32在HCC及其癌旁肝中的表達(dá)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)Cx32在二者中的表達(dá)陽性率明顯不同。癌周肝細(xì)胞的高強度表達(dá)與HCC細(xì)胞淡染甚至無陽性染色，形成明顯對比，顯示癌旁肝細(xì)胞與肝癌細(xì)胞間生物性質(zhì)不同。進(jìn)一步證實Cx32表達(dá)異常與HCC的形成及其惡性特征有關(guān)。

在不同分化的HCC組織中，Cx32的表達(dá)也存在差別，在HCCⅠ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級中的陽性率分別為 100%、40.62%、25.20%、16.66%，(P＜0.01)，提示分化程度降低，Cx32的表達(dá)水平逐漸下降，表達(dá)率有顯著差異。

現(xiàn)有同類研究已明確，間隙連接通訊功能的缺陷以間隙連接基因表達(dá)的異常為基礎(chǔ)，從而對腫瘤的惡性增殖和轉(zhuǎn)化進(jìn)行調(diào)控。對細(xì)胞生長、增殖、分化、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等起著重要的調(diào)節(jié)作用［7］。有認(rèn)為Cx32基因的穩(wěn)定表達(dá)可能有抑瘤用，可能具有重要抑癌因基。本研究提示，Cx32表達(dá)下降可能是HCC的發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，其分子機制尚需研究。NF-κB在正常肝組織及HCC組織中表達(dá)分別為21.34%(3/12)，71.28%(34/48)(P＜0.01)。同時NF-κB在高中低分化HCC組織中的表達(dá)率有顯著差異(P＜0。05)并與臨床TNM分期顯著相關(guān)(P＜0.05)，表明肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展與NF-κB的高表達(dá)有顯蓍相關(guān)性，同時檢測NF-κB與Cx32表達(dá)水平有助于判斷肝細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后。

［1］Karin M．NF-kappa B and cancer:mechanisms and targets．Mol Carcinog，2006，45(6):355-361．

［2］Karin M，Ben-Neriah Y．Phosphorylation meets ubiquitination:the control of NF-KB activity．Annu Rev Immunol，2000，l8(1):621-663．

［3］Konstantinopoulos PA，Vandoros GP，Sotiropoulou-Bonikou G，et al．NF-kappa B/PPAR gamma and/or AP-1/PPAR gamma＇on/off＇switches and induction of CBP in colon adenocarcinomas:correlation with COX-2 expression．International Journal of Colorectal Disease，2007，22(1):57-68．

［4］Baldwin AS．Series introduction:the transcription factor NF-kappa B and human disease．J Clin Invest，2001，107(1):3-6．

［5］Mesnil M.Connexins and cancer.Biol Cell，2002，94:493-500．

［6］Warn-Cramer BJ，Lin R，Martyn K，et al．Maintaining connexin 43 gap junctional communication in v-Src cells does not alter growth properties associated with the transformed phenotype.Cell Commun Adhes，2003，10:299-303．

［7］Tano T，F(xiàn)ujinoto E，Habiwara H，et al.Connexin 32 as an anti-invasive and anti-metastatic gene in renal cell carcinoma．Biol Pharm Bull，2006，29(10):1991-1994．