夏麗娟 李洪秀 李德華

在多數(shù)人類原發(fā)惡性腫瘤中，85%以上發(fā)現(xiàn)有端粒酶活性，但在人正常細(xì)胞(除生殖細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和造血干細(xì)胞外)則為陰性［1］。設(shè)計(jì)互補(bǔ)于hTR模板區(qū)的反義寡核苷酸封閉該模板區(qū)，就可抑制端粒酶合成端粒，從而使細(xì)胞退出增殖周期，達(dá)到治療腫瘤的目的，本研究將端粒酶PS-ASODN經(jīng)lipotap脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系HEC-1A，觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性的影響，同時(shí)檢測(cè)其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生長抑制作用，旨在探討PS-ASODN對(duì)子宮內(nèi)膜癌的治療價(jià)值，為臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)共分六組，不予正、反義核酸及脂質(zhì)體的空白對(duì)照組，脂質(zhì)體對(duì)照組，1.5 μM端粒酶PS-SODN組和濃度分別為0.5 μM、1.0 μM、1.5 μM 的 PS-ASODN 組。形態(tài)學(xué)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀均采用1.5 μM PS-ASODN。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%傳代。0.25%的胰蛋白酶分離消化細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

2.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活性 取各實(shí)驗(yàn)組HEC-1A細(xì)胞以5×104個(gè)/ml濃度接種在96孔板，每孔100 μl，待對(duì)數(shù)生長期時(shí)，實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為 0.5、1.0與 1.5 μM 的 PSASODN，脂質(zhì)體組加含脂質(zhì)體的DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組加入濃度為1.5 μM的端粒酶PS-SODN，空白對(duì)照組僅加DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取波長570 nm處OD值，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

2.2.3 端粒酶活性檢測(cè) 分別收集各組細(xì)胞(約1×106個(gè))，在反應(yīng)板中分別加入50 μl陰性對(duì)照、50 μl陽性對(duì)照，50 μl標(biāo)準(zhǔn)液和50 μl各實(shí)驗(yàn)組的端粒酶提取物于相應(yīng)反應(yīng)板孔中。酶標(biāo)儀上讀取450 nm處OD值。Index=樣品的OD值/標(biāo)準(zhǔn)液的OD值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 PS-ASODN作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖 如表1顯示，端粒酶PS-ASODN組HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖減慢，0.5 μM PS-ASODN 組細(xì)胞尚能緩慢增殖，1.0 μM PS-ASODN組細(xì)胞基本無明顯增殖，在48 h到72 h時(shí)間段，細(xì)胞增殖尤為緩慢。端粒酶PS-SODN組、空白對(duì)照組和脂質(zhì)體對(duì)照組HEC-1A細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間延長呈指數(shù)增長，不受藥物影響。

4.2 子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同濃度的端粒酶PS-ASODN后，不同時(shí)間的端粒酶活性見表2。各濃度組48 h時(shí)端粒酶皆表現(xiàn)為陰性，表明PS-ASODN能夠抑制端粒酶活性。

表1 各實(shí)驗(yàn)組HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖變化，(A值，，n=4)

表1 各實(shí)驗(yàn)組HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞體外增殖變化，(A值，，n=4)

注:t檢驗(yàn)，各組與對(duì)應(yīng)的空白對(duì)照組比較，△P＞0.05、*P＜0.05、＊＊P＜0.01

實(shí)驗(yàn)分組0.017脂質(zhì)體對(duì)照 0.256±0.005△ 0.613±0.013△ 0.752±0.013△ 0.793±0.012△PS-SODN 0.252±0.015△ 0.610±0.014△ 0.744±0.020△ 0.777±0.018△0.5 μM PS-ASODN 0.238±0.009* 0.429±0.012* 0.474±0.009＊＊ 0.564±0.011＊＊1.0 μM PS-ASODN 0.228±0.014* 0.380±0.020＊＊ 0.3798±0.011＊＊ 0.485±0.013＊＊1.5 μMPS-ASODN 0.213±0.020* 0.324±0.022＊＊ 0.310±0.022＊＊ 0.392±0.013 24 h 48 h 72 h 96 h空白對(duì)照 0.261±0.012 0.628±0.010 0.769±0.021 0.807±＊＊

表2 端粒酶PS-ASODN對(duì)HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性的影響(，n=4)

表2 端粒酶PS-ASODN對(duì)HEC-1A子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞端粒酶活性的影響(，n=4)

注:index≥1為+index在0.91～0.99之間為+/-index≤0.90為-

實(shí)驗(yàn)分組培養(yǎng)時(shí)間0.047 PS-SODN組 1.296±0.023 1.214±0.039 1.323±0.035 1.317±0.025脂質(zhì)體對(duì)照 1.278±0.045 1.282±0.045 1.327±0.028 1.356±0.036 0.5 μM PS-ASODN 0.988±0.039 0.878±0.022 0.718±0.023 0.762±0.019 1.0 μM PS-ASODN 0.848±0.055 0.817±0.014 0.766±0.014 0.769±0.016 1.5 μM PS-ASODN 0.740±0.025 0.717±0.025 0.696±0.24 h 48 h 72 h 96 h空白對(duì)照 1.373±0.036 1.146±0.027 1.269±0.030 1.291±016 0.760±0.032

5 討論

應(yīng)用封閉人端粒酶RNA為靶序列的反義寡核苷酸在體內(nèi)外能明顯抑制癌細(xì)胞中的端粒酶活性及細(xì)胞的增殖［2］，早在1995年，F(xiàn)eng等就用反義hTR轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中端粒酶活性明顯降低，端?？s短［3］。國內(nèi)學(xué)者用端粒酶反義核酸進(jìn)行體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能抑制多種癌細(xì)胞的端粒酶活性［4］。此點(diǎn)在本研究同樣得到了證實(shí)，我們的結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株HEC-1A細(xì)胞中端粒酶活性呈陽性表達(dá)，經(jīng)端粒酶PS-ASODN作用后HEC-1A細(xì)胞端粒酶活性受到抑制。而端粒酶PS-SODN對(duì)HEC-1A細(xì)胞的端粒酶無抑制作用。提示PS-ASODN對(duì)細(xì)胞端粒酶活性的抑制作用是序列特異性的。

［1］Zamaratski E，Pradeepkumar PI，Chattopadhyaya J.A critical survey of the structure-function of the antisense oligo/RNA heteroduplex as substrate for RNAse H.J Biochenm Biophys Methods，2001，28，48(3):189-208.

［2］Greider CW，Blackburn EH.Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts.Cell，1985，43:405-413.

［3］Feng RH，Zhu ZG，Li JF，et al.Inhibition of human telomerase in MKN-45 cell line by antisense hTR expression vector induces cell apoptosis and growth arrest.World J Gastroenterol，2002，8(3):436-400.

［4］MandalM，kumarR，et al.Bcl-2 modulatestelomeraseactevity.Biolchem，2004，272(22):14183.