盧珺 Heming Wei張廣欽

微矩陣電極系統(tǒng)(Multielectrode array，MEA)是一個(gè)進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)易且具有創(chuàng)新意義的研究工具。其包括數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，MEA信號(hào)放大器和溫控系統(tǒng)，MEA信號(hào)放大器的核心部件含有60個(gè)鈦金微電極。通過(guò)MEA信號(hào)放大器可記錄到細(xì)胞及組織(心肌，腦片和肌肉)的電生理信號(hào)。數(shù)據(jù)可由內(nèi)置軟件計(jì)算分析。

自MEA問(wèn)世30多年以來(lái)，相關(guān)的技術(shù)不斷改進(jìn)。因其高效快捷的特點(diǎn)，MEA技術(shù)受到越來(lái)越多研究者的重視。其應(yīng)用范圍從最初的腦片擴(kuò)展到到體外培養(yǎng)的細(xì)胞以及多功能干細(xì)胞，如小鼠和人類的胚胎干細(xì)胞 (Embryonic stem cells，ESC)以及誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞或者心肌細(xì)胞。多功能干細(xì)胞分化的心肌和神經(jīng)細(xì)胞可反映人類在體細(xì)胞的生理特性，故可作為有價(jià)值的體外(細(xì)胞)疾病模型和藥物篩選工具，甚至自體細(xì)胞治療。目前，包括抗心律失常藥在內(nèi)的許多心血管藥物都作用于不同的離子通道。然而，抗心律失常藥同樣會(huì)導(dǎo)致心律失常的副作用［1］。諸如小鼠等動(dòng)物模型被應(yīng)用于研究遺傳型心律失?；颊叩幕蛲蛔兊墓δ苄愿淖?。但因?yàn)樾∈笈c人類在心肌上離子通道的類型和分布存在差異，且小鼠動(dòng)作電位時(shí)程更短，心律更快(=600bpm)，因此小鼠模型不能顯現(xiàn)出與人類相同的表現(xiàn)型［2］。2007年，科學(xué)家利用 c-Myc，Oct3/4，SOX2，Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子組合或者Oct-4，Sox2，Nanog，Lin 28將人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞［3，4］。iPS的問(wèn)世，為藥物開(kāi)發(fā)的早期工作中，特別是對(duì)藥理、代謝和毒性評(píng)價(jià)提供了人類各種細(xì)胞的生理模型。MEA系統(tǒng)作為一個(gè)簡(jiǎn)單新穎的實(shí)驗(yàn)工具，可對(duì)iPS分化的心肌細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期的體外研究。其具有簡(jiǎn)單高效的優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于離子通道藥物篩選和基礎(chǔ)研究。本實(shí)驗(yàn)將hiPSC-CMs與MEA系統(tǒng)的有機(jī)結(jié)合，可直接評(píng)估心血管藥物的有效性。從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮，我們的模型可用于個(gè)體化用藥研究，并有利于檢測(cè)心血管藥物的安全性和有效性。

本文旨在探討應(yīng)用MEA系統(tǒng)研究人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞電生理特性，并建立穩(wěn)定高效的心血管藥物篩選平臺(tái)。本文主要探討MEA技術(shù)在人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 MEA系統(tǒng)儀器與軟件 儀器:微矩陣電極系統(tǒng)(MultichannelSystems，Reutlingen，Germany)。微矩陣電極芯片(MultichannelSystems，Reutlingen，Germany)60個(gè)鈦金微電極(30 μm)，電極間距為200 μm。溫度控制系統(tǒng)(MultichannelSystems，Reutlingen，Germany)。軟件:MC_Rack采集分析軟件(Multichannel Systems)。

1.2 細(xì)胞和培養(yǎng)基 人類誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞(新加坡國(guó)家心臟中心提供)。培養(yǎng)基:低糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%胎牛血清 +1%谷氨酰胺+1%青霉素+1%鏈霉素(Sigma公司購(gòu)買(mǎi))。其他材料:0.1% 明膠。

1.3 方法

1.3.1 微矩陣電極芯片的清洗和處理 實(shí)驗(yàn)前，將微矩陣電極芯片浸泡于75% 酒精2 h，擦干后置于超凈臺(tái)，紫外光照射20 min，備用。

1.3.2 心肌細(xì)胞團(tuán)選擇與轉(zhuǎn)移 顯微操作下，選擇節(jié)律性跳動(dòng)，強(qiáng)力收縮，心律為30～60/min，且直徑在500 μm以上iPS分化的心肌細(xì)胞團(tuán)為操作對(duì)象，將其切割下來(lái)，并置于0.1% 明膠處理的MEA芯片上，確保心肌細(xì)胞團(tuán)置于并覆蓋在微電極表面。(圖1和圖2)。小心地加入細(xì)胞培養(yǎng)基。將芯片置于直徑為100毫米的細(xì)胞培養(yǎng)皿中并放入37℃的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。

圖1 微矩陣電極

1.3.3 實(shí)驗(yàn)記錄 至細(xì)胞團(tuán)穩(wěn)定貼附于MEA芯片后，啟動(dòng)加熱系統(tǒng)，調(diào)節(jié)溫度至37℃。將微矩陣電極芯片放入微矩陣記錄系統(tǒng)，打開(kāi)MC_Rack采集分析軟件，開(kāi)始采集心肌細(xì)胞電生理信號(hào)。待場(chǎng)電位信號(hào)穩(wěn)定后，開(kāi)始記錄，記錄時(shí)間為180 s，整個(gè)實(shí)驗(yàn)在37℃下進(jìn)行，心肌細(xì)胞團(tuán)維持在培養(yǎng)基中。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用MC_Rack分析軟件對(duì)記錄到的hiPSC-CMs的場(chǎng)電位(FPD)和心率進(jìn)行分析，利用Bazzet公式cFPD=FPD/√(RR interval)計(jì)算場(chǎng)電位時(shí)程。

2 結(jié)果

2.1 人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞培養(yǎng)與電生理記錄本實(shí)驗(yàn)成功將分化的心肌細(xì)胞團(tuán)貼附于微矩陣電極芯片，并保持節(jié)律性跳動(dòng)，為進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的心血管藥物篩選和基礎(chǔ)研究提供了保障。該實(shí)驗(yàn)成功記錄到人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的場(chǎng)電位。由于心肌細(xì)胞團(tuán)的大小和所處的位置不同，并非所有微電極都可檢測(cè)到電信號(hào)，圖3為60個(gè)電極分別記錄的細(xì)胞團(tuán)體外電信號(hào)的變化。

圖2 人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞

圖3 60個(gè)電極記錄的心肌細(xì)胞場(chǎng)電位

圖4 TTX對(duì)iPS心肌細(xì)胞的影響

2.2 河豚毒素(TTX)對(duì)人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞 場(chǎng)電位的影響 由圖4可見(jiàn)，場(chǎng)電位含有快速去極化下降支，平臺(tái)期和復(fù)極相。河豚毒素為Na+通道特異性阻斷劑，10 M的TTX降低心率，并阻斷Na+電流，縮短FP min的幅度(圖 5a，b)。

圖5

3 討論

人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞形成的體外模型與MEA系統(tǒng)相結(jié)合可作為臨床高效安全的心血管藥物篩選平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)應(yīng)用MEA系統(tǒng)研究人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞電生理特性，并建立穩(wěn)定高效的心血管藥物篩選平臺(tái)。

為證明MEA系統(tǒng)是否可作為理想的心血管藥物篩選工具，我們以人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞團(tuán)作為體外試驗(yàn)的對(duì)象，將其貼于微矩陣電極芯片，記錄心肌細(xì)胞的電生理信號(hào)以及藥物反應(yīng)，研究心肌細(xì)胞場(chǎng)電位和心率。本實(shí)驗(yàn)記錄到的電生理信號(hào)與人類胚胎干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞相似，并保持節(jié)律性跳動(dòng)，從而可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的心血管藥物篩選測(cè)試和基礎(chǔ)研究。

文獻(xiàn)報(bào)道場(chǎng)電位時(shí)程與動(dòng)作電位時(shí)程存在線性關(guān)系［5］。此外，場(chǎng)電位快速負(fù)偏倚與Na+通道活動(dòng)有關(guān)，F(xiàn)Pslow反映的是動(dòng)作電位平臺(tái)期L型Ca2+通道的活動(dòng)［5，6］。因此，依據(jù)其良好的時(shí)間空間分辨率，MEA系統(tǒng)可用于研究類似于動(dòng)作電位的場(chǎng)電位特性。

不同心血管藥物可作用于不同的離子通道，動(dòng)作電位的去極化是由于大量的鈉通道開(kāi)放引起的鈉離子大量、快速內(nèi)流所致。河豚毒素(TTX)作為鈉通道阻斷劑，可阻斷鈉離子活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心肌細(xì)胞團(tuán)經(jīng)10 M的TTX處理過(guò)后，心率降低，F(xiàn)P min明顯縮短。證明MEA系統(tǒng)可用于藥物對(duì)心肌細(xì)胞電生理特性的研究。

同胚胎干細(xì)胞一樣，小鼠iPS細(xì)胞和人類iPS細(xì)胞均可以分化成心肌細(xì)胞［7-9］。解決了由于缺少人自身的細(xì)胞模型而造成的藥物檢測(cè)程序費(fèi)時(shí)費(fèi)力，價(jià)格昂貴，效率低下和不準(zhǔn)確等不良因素。Moretti等［10］成功的從LQT患者的皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS并定向分化成心肌細(xì)胞，重現(xiàn)了心電圖所觀察的QT間期的延長(zhǎng)。人類胚胎干細(xì)胞和人類誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞(hESC-CMs和hiPSC-CMs)均可用于對(duì)心臟毒性篩選的研究［11］。而且，心血管藥物直接作用于患者自身的hiPSC-CMs更具有臨床意義［12-13］。MEA系統(tǒng)可成功記錄心肌細(xì)胞的電生理信號(hào)并可評(píng)價(jià)藥物對(duì)心肌細(xì)胞的作用，有利于在藥物研發(fā)過(guò)程中評(píng)價(jià)劑量依賴性和不良反應(yīng)的關(guān)系［14］。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需注意以下三點(diǎn):①選擇心肌細(xì)胞團(tuán)時(shí)，以節(jié)律性強(qiáng)力收縮，心律在0.5～1 Hz范圍，且直徑在500 μm以上的心肌細(xì)胞為宜。在切割心肌細(xì)胞團(tuán)時(shí)可適當(dāng)切取心肌細(xì)胞團(tuán)周?chē)某衫w維細(xì)胞，有利于心肌細(xì)胞團(tuán)貼附于MEA芯片。②因?yàn)樵谂囵B(yǎng)過(guò)程中，由于心肌細(xì)胞團(tuán)的強(qiáng)力自發(fā)跳動(dòng)，會(huì)出現(xiàn)移位現(xiàn)象，而導(dǎo)致電極不能檢測(cè)到電信號(hào)。故hiPSC-CMs必需穩(wěn)定的覆蓋于MEA芯片電極表面，確保電極可采取到新信號(hào)。③在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，須利用Bazzet公式cFPD=FPD/√(RR interval)計(jì)算場(chǎng)電位時(shí)程，排除心率對(duì)場(chǎng)電位時(shí)程的干擾。

本實(shí)驗(yàn)以人類多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，應(yīng)用MEA系統(tǒng)記錄細(xì)胞外電生理特性。在證實(shí)MEA系統(tǒng)可用于長(zhǎng)期的體外模型實(shí)驗(yàn)，并為因缺乏適合的疾病模型而導(dǎo)致的生理病理研究鋪平道路。其次，與一般急性分離的心肌細(xì)胞相比，多功能干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)，有利于研究者進(jìn)行短期或長(zhǎng)期研究。hPSC-CMs培養(yǎng)于微矩陣電極芯片上可進(jìn)行多次反復(fù)的檢測(cè)。另外，MEA系統(tǒng)具有操作簡(jiǎn)單，高效快速的特點(diǎn)，在未來(lái)的臨床研究中，作為高通量心血管藥物臨床篩選工具進(jìn)行大規(guī)模的藥物試驗(yàn)研究。

［1］Morganroth J.Proarrhythmic effects of antiarrhythmic drugs:evolving concepts.Am Heart J，1992，123(4):1137-1139.

［2］Papadatos GA，Wallerstein PM，Head CE，et al.Slowed conduction and ventricular tachycardia after targeted disruption of the cardiac sodium channel gene Scn5a.ProcNatl Acad Sci U S A，2002，99:6210-6215.

［3］Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell，2007，131:861-872.

［4］Yu J，Vodyanik MA，Smuga-Otto K，et al.Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science，2007，318:1917-1920.

［5］Halbach M，Egert U，Hescheler J，et al.Estimation of action potential changes from field potential recordings in multicellular mouse cardiac myocytes cultures.Cell Physiol Biochem，2003，13:271-284.

［6］Morad M，Tung L.Ionic events responsible for the cardiac resting and action potential.Am J Cardiol，1982，49:584-594.

［7］Schenke-Layland K，Rhodes KE，Angelis E，et al.Reprogrammed mouse fibroblasts differentiate into cells of the cardiovascular and hematopoietic lineages.Stem Cells，2008，26:1537-1546.

［8］Narazaki G，Uosaki H，Teranishi M，et al.Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.Circulation，2008，118:498-506.

［9］Zhang J，Wilson GF，Soerens AG，et al.Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.Circ Res，2009，104:30-41.

［10］Moretti A，Bellin M，Welling A，et al.Patient-speci cinduced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.N Engl J Med，2010，363:1397-1409.

［11］Braam SR，Tertoolen L，van de Stolpe A，et al.Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes.Stem Cell Res，2010，4(2):107-116.

［12］Shiba Y，Hauch KD，Laflamme MA.Cardiac applications for human pluripotent stem cells.Curr Pharm Des，2009，15(24):2791-2806.

［13］Kamp TJ，Lyons GE.On the road to iPS cell cardiovascular applications.Circ Res，2009，105(7):617-619.

［14］Tanaka T，Tohyama S，Murata M，et al.In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.Biochem Biophys Res Commun，2009，385:497-502.