田少君 馬宇翔 張君旗

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

HPLC檢測(cè)火腿腸中大豆分離蛋白的方法研究

田少君 馬宇翔 張君旗

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

利用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定火腿腸中大豆分離蛋白的含量。色譜條件為:Xb ridge BEH300 C4色譜柱;蒸發(fā)光散射檢測(cè)器;梯度洗脫;流動(dòng)相 A:0.05% 三氟乙酸－HPLC級(jí)水溶液，B:0.05%三氟乙酸四氫呋喃溶液;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長254 nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量20μ L。大豆分離蛋白在1%～9%含量范圍內(nèi)與特征峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=2 923.1 X－970.85，相關(guān)系數(shù)R=0.994 2，平均回收率為99.30%，RSD為2.04%。HPLC法準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好，為火腿腸中大豆分離蛋白的定量檢測(cè)提供了可選擇的方法。

高效液相色譜法 肉蛋白 大豆分離蛋白 含量測(cè)定

大豆分離蛋白添加到火腿腸中能提高其出品率，增加蛋白質(zhì)的含量，并賦予產(chǎn)品良好的組織形態(tài)。最近幾年，非肉蛋白，特別是大豆分離蛋白添加到肉制品中的現(xiàn)象普遍存在［1－2］。許多國家和地區(qū)對(duì)火腿腸中添加大豆分離蛋白的量均有限制，因?yàn)檫^量添加會(huì)嚴(yán)重影響肉制品的質(zhì)量［3］。在美國灌腸制品、面包、燉食品及湯中可添加高至2%的大豆分離蛋白和3.5%的大豆粉或濃縮物［4］，我國于2007年實(shí)施的GB/T 20712—2006《火腿腸》國家標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)火腿腸中非肉蛋白的添加限量進(jìn)行明確規(guī)定。隨著這一標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，該類產(chǎn)品非肉蛋白的含量是需要明確標(biāo)示的。為評(píng)價(jià)大豆分離蛋白添加量是否符合產(chǎn)品標(biāo)示的要求，需要一種簡單可靠的分析方法檢測(cè)肉制品中的大豆蛋白。

肉制品中大豆蛋白分離檢測(cè)方法在國外已有相關(guān)報(bào)道，主要有 SDS－PAGE 法［5］和免疫化學(xué)法［6］。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是檢測(cè)肉制品中大豆分離蛋白的AOAC官方方法。然而，這些方法都有其局限性。SDS－PAGE法具有快捷靈便，設(shè)備簡單等優(yōu)點(diǎn)，但是定量效果較差;酶聯(lián)免疫法特異性好，快速，但需要特殊的免疫血清，價(jià)格昂貴。目前國內(nèi)有關(guān)肉制品中大豆分離蛋白的檢測(cè)方法報(bào)道較少，本試驗(yàn)在國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，采用高效液相色譜法對(duì)肉制品中添加的非肉蛋白進(jìn)行了研究，并對(duì)市售火腿腸樣品進(jìn)行了測(cè)定。以期找到一種方便、快捷、準(zhǔn)確的分析方法來評(píng)價(jià)肉制品添加的大豆分離蛋白是否符合產(chǎn)品標(biāo)示的要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

大豆分離蛋白:吉林不二蛋白有限公司;豬后腿肌肉和豬肉肥膘:雙匯連鎖店;4種火腿腸(編號(hào)1～4):鄭州華潤萬家超市。

乙腈，三氟乙酸均為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

Waters 2690高效液相色譜儀和蒸發(fā)光散射檢測(cè)器:美國Waters公司;3K－15高速離心機(jī):美國Sigma公司;SHZ－88水浴恒溫振蕩器:江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 肉樣品的制備

原料肉→解凍→絞肉→攪拌(添加1%，3%，5%，7%，9%的大豆蛋白)→斬拌→蒸煮→冷卻→保存

將原料肉解凍，分別用絞肉機(jī)絞碎，將原料肉、冰水、大豆分離蛋白(預(yù)先用水調(diào)成漿狀)和食鹽，攪拌5 min，在組織搗碎機(jī)攪拌1 min后，加入豬肥膘繼續(xù)攪拌4 min，注意溫度不要超過15℃，將肉糜充入50 mL塑料離心管中，蓋緊，制成成品在80℃的水浴中加熱30 min，冷卻至室溫，并在4℃環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?－8］。

1.2.2 樣品的前處理

精確稱取1.000 g含不同大豆分離蛋白的肉樣品和不同品牌火腿腸樣品，放入錐形瓶中，加入碳酸鹽緩沖液(pH 9.60)60 mL，在60℃的恒溫振蕩器中攪拌2 h，然后再以8 000 g離心力離心10 min后，保留上清液;殘?jiān)锰妓猁}緩沖液(pH 9.60)60 mL重復(fù)提取1次，合并上清液，過 0.45 μm 膜，濾液供HPLC測(cè)定。

1.2.3 HPLC 條件

Xb ridge BEH300 C4色譜柱(150 mm ×4.6 mm，3.5 μm);流動(dòng)相，溶劑 A:0.05% 三氟乙酸 HPLC 級(jí)水溶液;溶劑B:溶劑B:0.05%三氟乙酸四氫呋喃溶液，3個(gè)洗脫梯度，5%～25%、25%～42%、42%～50%;線性梯度13 min，流速 1.0 mL/min;檢測(cè)波長254 nm;柱溫30 ℃;進(jìn)樣量 20 μL。

1.2.4 HPLC分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)大豆分離蛋白的肉樣品溶液在上述確定的條件下進(jìn)行液相分析，同時(shí)做空白試驗(yàn)。根據(jù)圖譜選擇出特征峰定量分析肉制品中大豆分離蛋白的含量。以肉制品中添加大豆分離蛋白的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，所選特征峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程。

1.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一次制得的樣品溶液，分別重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積，檢驗(yàn)方法的精密度。1.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批配制的肉制品蛋白溶液上清液5份，每一份重復(fù)進(jìn)樣5次，根據(jù)上述色譜條件，測(cè)定其特征峰的峰面積，檢驗(yàn)方法的重現(xiàn)性。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取新配制的肉制品蛋白溶液上清液各1份，分別在3、6、9、12、15、18、21、24 h 注入色譜儀，測(cè)定其特征峰的峰面積。

1.2.8 回收率試驗(yàn)

取已知大豆分離蛋白含量的樣品溶液，精確加入一定量大豆分離蛋白，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算回收率，檢驗(yàn)方法的可行性。

1.2.9 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本方法測(cè)定市售火腿腸中大豆分離蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉制品中大豆分離蛋白的提取

大豆蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在4.2～4.6之間，因此選用弱堿性的緩沖溶液能提高大豆蛋白質(zhì)的溶解性。購得的原料肉先前已用丙酮去除脂肪，嘗試用不同的溶劑提取大豆分離蛋白:0.05 mol/L Tris－HCl緩沖溶液(pH 8.30)，0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖溶液(pH 9.60/10.00/11.00)，0.05 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.00)。在其他條件保持相同的情況下，以混合蛋白的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳的提取溶劑。試驗(yàn)結(jié)果如圖1，0.05 mol/L碳酸鹽緩沖溶液在pH 9.60時(shí)對(duì)肉制品中蛋白質(zhì)提取率最高。

圖1 不同體系緩沖溶液對(duì)肉制品中蛋白質(zhì)的提取率

2.2 流動(dòng)相的選擇

豬肉和大豆分離蛋白都是混合物，盡管前處理凈化步驟已除去很多雜質(zhì)，但是仍有一些雜質(zhì)干擾大豆分離蛋白的定性和定量。為此，本研究進(jìn)一步通過優(yōu)化流動(dòng)相實(shí)現(xiàn)干擾物質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)的分離。在參考其他文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上［9－10］，起初選擇試驗(yàn)條件:溶劑 A:0.1%三氟乙酸 HPLC級(jí)水溶液;溶劑 B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液1%～45%B，45%～100%B，線性梯度16 min，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min。在這些試驗(yàn)條件下，對(duì)未添加和添加了大豆分離蛋白的肉樣品進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示這些色譜條件下分析不夠成功，因?yàn)槿鈽悠啡芤褐械囊恍┏煞直粡?qiáng)烈地保留在固定相上，不易從柱子上洗脫下來。為了克服這個(gè)問題，嘗試了具有更高洗脫強(qiáng)度的有機(jī)改性劑四氫呋喃(THF)和更低濃度的三氟乙酸(0.05%，體積比)，并對(duì)12個(gè)線性梯度進(jìn)行嘗試。從這些試驗(yàn)中，選擇了線性梯度5%～25%B，25%～42%B和42%～50%B。在上述優(yōu)化的條件下，大豆分離蛋白溶液、未添加大豆分離蛋白的肉制品溶液及兩者的混合溶液分離效果較好。

2.3 HPLC分離肉制品中的大豆分離蛋白分析

按照選定的方法準(zhǔn)備樣品，將添加大豆分離蛋白的肉制品、空白肉蛋白、大豆分離蛋白樣品溶液分別進(jìn)液相測(cè)定。圖2為選定的色譜條件下大豆分離蛋白的色譜圖，從圖2中可以看出，大豆分離蛋白各組分在保留時(shí)間 1.042、2.219、5.719、6.383、7.485、8.173、8.389 min 處有較大的吸收峰;空白肉蛋白在保留時(shí)間1.870、2.173、2.321、8.027 min 處有較大的吸收峰(圖3)，混合蛋白質(zhì)(大豆分離蛋白和肉蛋白)的色譜圖在保留時(shí)間 1.040、2.215、5.715、6.382、7.483、8.151、8.359、8.172、8.383 min 出現(xiàn)了較大的吸收峰(圖4)。經(jīng)過比較可以知道，肉蛋白在保留時(shí)間4～7 min處沒有明顯的吸收峰，進(jìn)一步增大肉蛋白的濃度時(shí)也沒有出現(xiàn);大豆分離蛋白在保留時(shí)間5.719、6.383 min處出現(xiàn)了較大的吸收峰，在兩者的混合蛋白中也出現(xiàn)了這些吸收峰。經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)，可以確定這兩個(gè)吸收峰為大豆分離蛋白區(qū)別于肉蛋白的特征峰。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將1.2.2中的配制好的分別含有1%、3%、5%、7%、9%的大豆分離蛋白肉樣品上清液進(jìn)樣，每次進(jìn)樣20 μL，以特征峰(t=6.382 或 6.383 min)峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)百分含量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得出線性方程，相關(guān)系數(shù)為0.994 2，表明線性關(guān)系良好。方法檢出限(3 S/N)為0.33%，定量限(10 S/N)為1.10%。

圖5 HPLC檢測(cè)肉樣品中大豆蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度試驗(yàn)

對(duì)按1.2.2法制備的同一樣品按1.2.3中的色譜條件做6個(gè)平行樣進(jìn)行進(jìn)樣分析，得到的特征峰(保留時(shí)間為6.383 min)的面積見表1，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.05%，表明該方法具有良好的精密度。

表1 精密度試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取按1.2.2法新鮮制備的同一樣品溶液，分別在 0，3，6，9，12，15，18，21，24 h 按 1.2.3 中的色譜條件依次進(jìn)樣20μL，共測(cè)定8次。由表2可知，樣品響應(yīng)值在前24 h內(nèi)非常穩(wěn)定，特征峰峰面積的RSD為0.16%。24 h后響應(yīng)值會(huì)有較大變化，表明該含大豆分離蛋白樣品在一段時(shí)間后會(huì)發(fā)生變化，推測(cè)可能有微生物利用所致，因此測(cè)定最好是在24 h內(nèi)完成。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn)

對(duì)按1.2.2法平行制備的同一樣品(含7%大豆分離蛋白的肉樣品蛋白質(zhì))5份按1.2.3中的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析，得到的特征峰(保留時(shí)間為6.383 min)的面積見表3，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，表明該方法具有很好的重現(xiàn)性。

表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.8 回收率試驗(yàn)

取同一次制得的已知大豆分離蛋白含量的肉樣品溶液5份，分別精確加入一定量的大豆分離蛋白對(duì)照品，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果大豆分離蛋白的平均回收率為99.30%，RSD 為2.04%(n=5)，加標(biāo)回收效果較好。

表4 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 市售樣品測(cè)定

為了驗(yàn)證高效液相色譜法在檢測(cè)火腿腸中大豆分離蛋白的可行性，選擇了市場上的4種品牌火腿腸，按1.2.2方法制成供試品溶液，進(jìn)樣并平行測(cè)定3次，以峰面積的平均值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出大豆分離蛋白的含量。試驗(yàn)結(jié)果表明不同品牌或者同一品牌不同系列火腿腸之間添加的大豆分離蛋白參差不齊，由于其添加量的不同會(huì)對(duì)火腿腸品質(zhì)產(chǎn)生一定影響，因此應(yīng)在火腿腸包裝上進(jìn)行標(biāo)注或者出臺(tái)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范其在火腿腸中的添加量。

表5 商業(yè)樣品的大豆分離蛋白含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用碳酸鹽緩沖溶液提取、凈化樣品溶液，建立了HPLC測(cè)定肉制品中大豆分離蛋白含量的方法。大豆分離蛋白特征峰峰面積與其添加量間的線性回歸方程為 Y=2 923.1X－970.85，相關(guān)系數(shù)R=0.994 2;大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～9%范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;平均加樣回收率為99.30%，RSD為2.04%，檢出限為0.33%，定量限為1.10%。

［1］柯旭清.大豆蛋白在食品加工中的應(yīng)用［J］.農(nóng)業(yè)科技，2007(11):106－107

［2］張福，楊艷敏.大豆蛋白在肉制品中的重要作用［J］.肉類工業(yè)，2005(1):34－36

［3］毛迪銳，繆銘.大豆分離蛋白在肉制品中的應(yīng)用［J］.肉類工業(yè)，2005(4):42－44

［4］Hussman H C.Regulations governing the use of soy protein in meat and poultry products［J］.Journal of American Oil Chemists’Society，1974，51(1):104 －106

［5］Belloque J，García M C，Torre M ＆ Marina M L.Analysis of soyabean proteins in meat products［J］.Food Science and Nutrition，2002，42:507 －532

［6］AOAC Official Method 998.10.Soy protein in raw and heatprocessed meat products，Enzyme － Linked Immunosorbent Assay［S］

［7］Lin K M，Mei M Y.Influences of gums，soy protein isolate，and heating temperatures on reduced－fat meat batters in a model system［J］.Journal of Food Science，2000，65(1):48－52

［8］雷雨.火腿腸生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制［J］.食品科技，1999(5):22－23

［9］Concepción García M，Domínguez M，García － Ruiz C.Reversed phase high performance liquid chromatography applied to the determination of soybean proteins in commercial heatprocessed meat products［J］.Analytica Chimica Acta，2006，559:215－220

［10］Castro F，García M C，Rodríguez R.Determination of soybean proteins in commercial heat－processed meat products prepared with chicken，beef or complex mixtures of meats from different species［J］.Food Chemistry，2007，100:468－476.

Study on the Determination of Soy Protein Isolate in Sausage by HPLC

Tian Shaojun Ma Yuxiang Zhang Junqi
(Faculty of Food Science and Engineering，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001)

A method for the determination of soy protein isolate in sausage by high performance liquid chromatography(HPLC)was established.The optimum chromatograph parameters were set as following:analytical column as Xb ridge BEH300 C4，evaporative light－scattering detector(ELSD)and gradient elution;mobile phases:A，0.05%TFA in water;B，0.05%TFA in THF;flow rate of mobile phase 1.0 mL/min，detector wavelength at 254 nm，column temperature 30℃ and injection volume 20μL.The linear range of SPI in sausage was 1%～9%.The regression equation was Y=2 923.1X － 970.85，and the correlation coefficient was 0.994 2.The average recovery of the method is 99.30%，and RSD is 2.04%.HPLC method is accurate with good precision stability and repetition.It provides an optional analysis for determination of soy protein isolate in sausage and can be used to control the product qualities.

HPLC，meat protein，soy protein isolate，content determination

TS201.2

A

1003－0174(2012)04－0101－05

2011－08－25

田少君，女，1964年出生，教授，植物蛋白科學(xué)與工程技術(shù)