張衛(wèi)兵，梁 琪，喬海軍，米 蘭，張 炎，楊 敏，甘伯中

（甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅省干酪素工程技術研究中心，甘肅蘭州730070）

紫外線和硫酸二乙酯誘變高產凝乳酶地衣芽孢桿菌的研究

張衛(wèi)兵，梁 琪，喬海軍，米 蘭，張 炎，楊 敏，甘伯中*

（甘肅農業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅省干酪素工程技術研究中心，甘肅蘭州730070）

以產凝乳酶地衣芽孢桿菌為出發(fā)菌株，通過紫外線誘變和硫酸二乙酯誘變，提高菌株的凝乳活力。經反復誘變篩選獲得一株凝乳活力較高且水解活力較低的突變株DES-6，其凝乳活力為184.65SU/mL，比原菌株增加了15.41%，水解活力為23.35U/mL，比原菌株降低了64.80%。傳代實驗表明，突變株DES-6具有穩(wěn)定的遺傳性。

凝乳酶，地衣芽孢桿菌，誘變

凝乳酶是奶酪生產中使乳液凝固的關鍵性酶，又稱天冬氨酸蛋白酶，能專一性裂解κ-酪蛋白多肽鏈的105～106位的苯丙氨酸和甲硫氨酸之間的肽鍵，形成穩(wěn)定及親水性的糖巨肽，評價凝乳酶優(yōu)劣的兩個重要指標是凝乳酶活力和蛋白水解力[1]。目前，國際市場上凝乳酶中動物來源的接近70%，微生物來源的占30%，植物來源的不到1%。微生物生長周期短，產量大，受氣候、時間限制小，用其生產凝乳酶成本低、經濟效益高，因而利用微生物生產凝乳酶是目前最有前途的發(fā)展方向[2-6]。目前關于產凝乳酶菌株的誘變選育的研究大多集中在真菌，對細菌的報道較少。郭光遠[7]等人以毛霉Y85-8512作為出發(fā)菌，經誘變選育得到酶活比值高且凝乳活力可達5000U/g的菌株。孫建[8]等從17株產凝乳酶的霉菌中通過放射誘變選出一株高產菌株，再進行60Co-γ射線誘變，得到變異株R132，其凝乳活力提高了80%，酶活比值提高了65%。廖亮[9]等以米黑毛霉和黑曲霉為出發(fā)菌株，分別進行紫外線照射、脫氧膽酸鈉處理和常壓低溫等離子體誘變，選育到一株凝乳酶產量高，蛋白質水解活力小的黑曲霉L-2-12。邵淑娟[10]等采用微波輻照方法對產凝乳酶的黑曲霉JG進行處理，選育出的突變株WB6-3、WB2-5，凝乳活力分別提高了35%和14%。蔣詠梅[11]以Y-12為出發(fā)菌株，經紫外線和硫酸二乙酯處理后，獲得3株產酶水平比出發(fā)菌株提高200%以上的菌株。Higashio[12]篩選得到了NTG突變株Mucor racemosus No.50，并研究了其在10L的發(fā)酵罐中的最佳培養(yǎng)條件。本研究以實驗室從甘肅天祝牦牛放牧區(qū)土壤中分離的產凝乳酶地衣芽孢桿菌[13]為出發(fā)菌株，通過紫外線和硫酸二乙酯兩種誘變方式進行誘變，篩選凝乳活力較高而水解活力較低的菌株，為細菌凝乳酶的發(fā)酵生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis） 甘肅農業(yè)大學乳品科學與技術實驗室篩選并保存，編號D3.11；干酪素 甘肅華羚生物科技有限公司，食品級；脫脂奶粉 完達山乳業(yè)股份有限公司，食品級；麩皮 蘭州市安寧區(qū)桃海市場，市售；酪蛋白培養(yǎng)基 蛋白胨2.5g，葡萄糖10g，酵母膏1g，干酪素10g，瓊脂20g，脫脂乳粉5g，補足蒸餾水1000mL，pH7.0；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（液體） 蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸餾水1000mL，pH7.4；產酶培養(yǎng)基 稱取12g麩皮，加入100mL自來水，煮沸10min，用四層紗布過濾，濾液補水至100mL后分裝，121℃下滅菌20min，pH自然。

SW-CJH-1FD單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備廠；MICRO17TR冷凍高速離心機 Korea；PHS-3C型雷磁pH計 上海雷磁儀器廠；HZQ-X300恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；DC-1006低溫恒溫槽 寧波江南儀器廠；722型分光光度計 上海棱光技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將菌種活化后，接種于裝有20mL液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，于37℃，170r/min培養(yǎng)15h后，吸取5mL培養(yǎng)液，加入裝有45mL生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩20min，使菌體在玻璃珠的攪拌下，充分打散。

1.2.2 紫外線誘變處理 將菌懸液用生理鹽水稀釋至約108～109個/mL，分別吸取9mL菌懸液于4個無菌培養(yǎng)皿中，用30W紫外燈，照射距離30cm，照射時間分別為0、30、60、120、180s，取處理過的菌懸液稀釋后涂布于酪蛋白平板上，37℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，進行初篩和復篩，分別計算存活率和正突變率。

1.2.3 硫酸二乙酯（DES）誘變處理 在裝有20mL菌懸液（108～109個/mL）帶玻璃珠三角瓶中，分別加入硫酸二乙酯原液0.2mL，搖床振蕩處理30、40、50、60、90min，立即取5mL處理液于無菌試管中，加入1mL 25%硫代硫酸鈉溶液終止反應，取處理過的菌懸液稀釋后涂布于酪蛋白平板上，37℃恒溫培養(yǎng)至長出菌落，進行初篩和復篩，分別計算存活率和正突變率。

1.2.4 初篩 在平板菌落計數后，選取致死率在60%～80%左右的平板，將平板上的菌落分別用無菌接種針挑取到酪蛋白培養(yǎng)基上初篩，37℃培養(yǎng)24h，測量凝乳圈直徑和菌落直徑，選擇凝乳圈直徑和菌落直徑比值大的菌株進行復篩。

1.2.5 復篩 將突變株活化后，接種于裝有20mL產酶培養(yǎng)基的50mL三角瓶中，37℃、170r/min振蕩培養(yǎng)48h。將發(fā)酵液8000r/min離心5min，得到粗酶液，測定其凝乳活力與蛋白水解活力。

1.2.6 突變株的遺傳穩(wěn)定性 將誘變選出的凝乳活力較高的菌株連續(xù)傳代8次，測定酶活，通過數據分析，判斷傳代次數對酶活性變化影響是否顯著。

1.3 酶活的測定

1.3.1 凝乳活力測定法[14]吸取在35℃下保溫10min的復原脫脂乳液5mL入試管中，添加0.5mL在35℃保溫10min的酶液，迅速搖勻并開始計時，當試管壁上出現凝集小顆粒即終止計時，計時以秒為單位。把40min凝固1mL 100g/L脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位（Soxhlet Unit，簡稱SU）。

式中：t為凝乳時間（s）；D為稀釋倍數。

溫柔的樹袋熊，女（PS：不要問女生年齡），明清史碩士（其實最稀罕魏晉士人來著），喜歡旅游（尤其是不用自己掏荷包那種）。長卷發(fā)、天秤座、愛吃辣椒，喜歡傳統(tǒng)君子士人：“謙謙君子，溫潤如玉”，可惜現代社會很難遇見，所以有了這篇文章。

1.3.2 蛋白水解活力測定方法[15]取15×100mm試管3支，編號1、2、3，每管內加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中預熱2min，再各加入經同樣預熱的酪蛋白1mL，精確保溫10min后，立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，以終止反應。繼續(xù)置于水浴中保溫20min，使殘余蛋白質沉淀后過濾。然后另取15×150mm試管3支，編號1、2、3，每管內加入濾液1mL，再加0.4mol/L碳酸鈉5mL，已稀釋的福林試劑1mL，搖勻，40℃保溫發(fā)色20min后進行光密度（OD660nm）測定。空白實驗也取試管3支，編號1、2、3，測定方法同上。唯在加酪蛋白之前先加0.4mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。

式中：K為每度OD660nm所相當的酪氨酸量；4為4mL反應液取出1mL測定（即4倍）；T為反應時間10min。

1.4 致死率和正突變率的計算[16]

將培養(yǎng)好的平板取出進行菌落計數，根據平板上菌落計數結果，計算致死率；根據酶活力測定結果，計算正突變率。

1.5 數據處理

用統(tǒng)計分析軟件SPSS15.0對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 紫外線對菌株的誘變效應

菌懸液經紫外線照射不同時間后，取樣稀釋，涂布于酪蛋白培養(yǎng)基上，待長出菌落后進行計數并測定酶活，不同處理時間下致死率和正突變率結果見圖1。

圖1 紫外線對菌株的誘變處理Fig.1 The effect of UV treatment on the strains

由圖1可看出，該菌株對紫外線照射比較敏感，隨照射時間的增加，菌體存活數量逐漸減少，照射60s時致死率達到77.6%，照射180s時，菌體致死率達到100%。正突變率則呈現先增大后減小的趨勢，照射60s時正突變率最高，可達16.28%。據報道，經紫外線誘變致死率達到95%～99%的劑量時，往往是回復突變株出現率最高的劑量，紫外線劑量控制在死亡率75%～80%時，菌株誘變效果較好[15]。在本實驗中，紫外線照射時間為60s時，致死率達77.6%，正突變率最高，所以選擇照射時間60s作為紫外線誘變的處理時間，進行重復誘變。

2.2 紫外誘變的初篩和復篩結果

表1 紫外誘變菌株的篩選結果Table 1 The screening result of UV treatment on the strains

由表1可以看出，經過紫外誘變后菌株的凝乳圈直徑與菌落直徑比增大的占多數，菌株UV-1的凝乳圈直徑與菌落直徑比值比出發(fā)菌株增大16.9%，為增幅最大的菌株。另外所列10株菌都在18s內凝固牛乳且終止pH都在5.8以上，排除了酸凝乳的可能。從酶活測定結果來看，菌株UV-1和UV-4的凝乳活力均比出發(fā)菌株增大，其中UV-1凝乳活力比原菌株提高了11.46%，其它菌株凝乳活力都有所減?。淮蠖鄶稻甑乃饣盍Χ急瘸霭l(fā)菌株減小，其中UV-9凝乳活力減小幅度最大，其水解活力比出發(fā)菌株降低了21.9%。從凝乳活力與蛋白水解活力的比值來看，比出發(fā)菌株增大的有菌株UV-1、UV-2、UV-4、UV-7，其中菌株UV-1的比值增幅最大，比出發(fā)菌株提高了19.92%。

2.3 硫酸二乙酯對菌株的誘變效應

菌懸液經硫酸二乙酯處理不同時間后取樣稀釋，涂布于酪蛋白分離平板上，待長出菌落后進行計數并測定酶活，計算在處理不同時間后該菌的致死率和正突變率，結果見圖2。

圖2 硫酸二乙酯對菌株的誘變處理Fig.2 The effect of diethyl sulfate treatment on the strains

由圖2可以看出，隨著硫酸二乙酯處理時間的增加，菌體致死率逐漸增大，處理30min時菌體的致死率為35.2%，處理90min時，菌體致死率達到88.54%。正突變率隨處理時間的增加先增大后減小，處理50min時正突變率達到15.38%，隨后正突變率逐漸減小。綜合考慮，選擇處理時間60min作為硫酸二乙酯誘變的處理時間，進行誘變處理。

2.4 硫酸二乙酯誘變的初篩和復篩結果

菌株經硫酸二乙酯處理不同時間后，取樣稀釋，涂布于分離平板上培養(yǎng)，待長出菌落后測定凝乳圈直徑、菌落直徑、水解活力和凝乳活力，部分菌株的測定結果見表2。

表2 硫酸二乙酯誘變菌株的篩選結果Table 2 The screening result of diethyl sulfate treatment on the strains

由表2可以看出，相對出發(fā)菌株，突變株DES-3、DES-4、DES-9和DES-10的凝乳圈直徑與菌落直徑比值減小，其余菌株凝乳圈直徑與菌落直徑比值都不同幅度地增大，DES-6的增大幅度最大，比出發(fā)菌株增大22%；從酶活測定結果來看，菌株DES-2、DES-6、DES-7的凝乳活力均比出發(fā)菌株增大，其中DES-6凝乳活力增加幅度最大，比原菌株提高了15.41%；大多數菌株的水解活力都比出發(fā)菌株減小，其中DES-9水解活力減小幅度最大，其水解活力比出發(fā)菌株降低了70.83%；從凝乳活力與蛋白水解活力的比值來看，大多數菌株的酶活比值都有所提高，其中DES-6的增幅最大，比出發(fā)菌株提高了2.28倍。

2.5 突變株的遺傳穩(wěn)定性

對凝乳活力高的突變株UV-1和DES-6連續(xù)傳代8代，測定每代菌株的凝乳活力，凝乳活力測定結果分別見表3和表5，方差分析結果分別見表4和表6。

表3 突變株DES-6不同代次的凝乳酶活力（SU/mL）Table 3 Milk-clotting enzyme activity of mutant DES-6 of different generation（SU/mL）

表4 突變株DES-6傳代實驗的方差分析Table 4 Variance analysis of generation test of mutant DES-6

由表3和表5可以看出，突變株UV-1不同代菌株

表5 突變株UV-1不同代次的凝乳酶活力（SU/mL）Table 5 Milk-clotting enzyme activity of mutant UV-1 of different generation（SU/mL）

表6 突變株UV-1傳代實驗的方差分析Table 6 Variance analysis of generation test of mutant UV-1

由表3和表5可以看出，突變株UV-1不同代菌株凝乳酶活力穩(wěn)定在174.25～177.71SU/mL之間，突變株DES-6不同代菌株凝乳酶活力穩(wěn)定在184.44～184.88SU/mL之間。通過方差分析（表4和表6）可知，突變株DES-6凝乳酶活力組間差異的P值遠遠大于0.05，說明傳代次數對酶活性變化影響不顯著，表明突變株DES-6具有穩(wěn)定的遺傳性。突變株UV-1凝乳酶活力組間差異的P值小于0.05，說明傳代次數對酶活性變化影響顯著，表明突變株UV-1不具有穩(wěn)定的遺傳性。

3 結論

3.1 通過實驗確定了地衣芽孢桿菌紫外線誘變最佳處理時間為60s；硫酸二乙酯誘變的最佳處理時間為60min。

3.2 紫外誘變后，經篩選得到一株凝乳活力增加幅度最大的突變株UV-1，凝乳活力為178.35SU/mL，比原菌株提高了11.46%；硫酸二乙酯誘變后，經篩選得到一株酶活比值大的菌株DES-6，凝乳活力為184.65SU/mL，比原菌株增加了15.41%，水解活力為23.35U/mL，比原菌株降低了64.80%，酶活比值比出發(fā)菌株提高了2.28倍。

3.3 對突變株UV-1和DES-6進行傳代穩(wěn)定性實驗，結果表明經傳代后，突變株DES-6的凝乳活力穩(wěn)定，遺傳性穩(wěn)定性好，突變株UV-1不具有穩(wěn)定的遺傳性。

[1]周俊清，林親錄，趙謀明.產高效凝乳酶菌株獲得方法的探討[J].食品科學，2005，26（3）：253-256.

[2]高維東，甘伯中，丁福軍，等.微生物凝乳酶的研究進展[J].中國乳品工業(yè)，2009，37（5）：34-37.

[3]曾劍超.國內凝乳酶及其代替品的研究進展[J].江蘇調味副食品，2008，25（1）：13-16.

[4]張紅梅，劉仲濱.凝乳酶的研究進展[J].同濟大學學報：醫(yī)學版，2004，25（3）：254-256.

[5]王明強，張惟廣.發(fā)酵法生產凝乳酶的概述[J].四川食品與發(fā)酵，2008，44（2）：21-24.

[6]周俊清，林親錄.微生物源凝乳酶的研究進展[J].中國食品添加劑，2004（2）：6-9.

[7]郭光遠，姜成林，馬俊.微生物凝乳酶的研究Ⅰ：菌株的篩選、發(fā)酵、制備及毒性[J].微生物學通報，1988，15（5）：207-210.

[8]孫健，宋曉紅，盧孟柱，等.總狀毛霉凝乳酶的研制及初步應用[J].微生物學通報，1994，2（1）：5-10.

[9]廖亮.凝乳酶高產菌株的選育及其發(fā)酵條件、酶學活性的相關研究[D].北京：北京化工大學，2010.

[10]邵淑娟，李鐵柱，李倬林，等.產凝乳酶黑曲霉JG的微波誘變育種研究[J].中國釀造，2010（7）：47-50.

[11]蔣詠梅，章文賢，施巧琴，等.豆凝乳酶產生菌的篩選及誘變育種[J].福建師范大學學報：自然科學版，2000，16（3）：89-93.

[12]Higashio K，Yoshioka Y.Milk clotting enzyme productionby NTG induced mutant of Mucor racemosus No.50.（Studies on milk clotting enzyme from microorganisms.V.）[J].Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan，1982，56（9）：777-785.

[13]宋曦，甘伯中，賀曉玲，等.天祝放牧牦牛生活環(huán)境土壤中一株產凝乳酶細菌的分離與鑒定[J].食品科學，2009，30（11）：158-162.

[14]ArimaK，ShinjiroI，GakuzoT.Milk-clotting enzymes from microorganism，Part I，Screening test and identification of potent fungus[J].Agric Biol Chem，1967，31（5）：540-545.

[15]SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定方法[S].

[16]劉慧.現代食品微生物學實驗技術[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2006.

Study on mutation breeding of Bacillus licheniformis producing chymosin by ultra violet and diethyl sulfate

ZHANG Wei-bing，LIANG Qi，QIAO Hai-jun，MI Lan，ZHANG Yan，YANG Min，GAN Bo-zhong*
（College of Food Science and Engineering，Gansu Provincial Key Laboratory of Functional Dairy，Gansu Casein Engineering Technical Research Centre，Lanzhou 730070，China）

Bacillus licheniformis producing chymosin was mutated by ultraviolet and diethyl sulfate to improve the ability of producing chymosin.After screening repeatedly，a mutant DES-6 with high activity of chymosin and lower proteolysis was obtained.Compared with the original strain，the activity of chymosin increased by 15.41%，the proteolytic activity reduced by 64.80%.DES-6 had good hereditary stability after several generations. Key words：chymosin；Bacillus licheniformis；mutation

TS201.3

A

1002-0306（2012）05-0174-04

2011-04-28 *通訊聯系人

張衛(wèi)兵（1974-），男，副教授，博士，研究方向：應用微生物。

國家863計劃（2011AA100903）；甘肅省科技重大專項（0702NKDA034）；甘肅農業(yè)大學校創(chuàng)新基金（GAU-CX1107）。