周 清， 郭嫻吟， 楊筱曦， 陳 劍△

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，廣東廣州510632;2東莞石龍人民醫(yī)院眼科，廣東東莞523320)

翼狀胬肉是一種常見(jiàn)的多發(fā)的眼表疾病，組織學(xué)以成纖維細(xì)胞異常增殖、膠原大量合成、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為組織學(xué)特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了深入的研究，但確切的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明了。目前明確其病因與太陽(yáng)光紫外線(xiàn)(ultraviolet rays，UVR)照射有關(guān)，通過(guò)與之相關(guān)的自由基使大分子失活［1］。近10年來(lái)，通過(guò)分子遺傳學(xué)技術(shù)，對(duì)翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制研究收獲頗多［2］。藥物能在分子水平抑制血管生成及細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制翼狀胬肉的生長(zhǎng)是目前一個(gè)新的研究方向［3－4］。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factorβ，TGF－β)在各種類(lèi)型的纖維化疾病中的過(guò)度異常表達(dá)可能是引起組織纖維化的重要機(jī)制之一，被認(rèn)為是目前最重要的致纖維化細(xì)胞因子之一。研究表明:在翼狀胬肉的上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞及基底膜，成纖維細(xì)胞均有過(guò)量的TGF－β表達(dá)，體外培養(yǎng)的翼狀胬肉成纖維細(xì)胞可被TGF－β促增殖［5］?；赥GF－β在翼狀胬肉的發(fā)生及反應(yīng)進(jìn)程中的重要作用，能特異性地抑制TGF－β生物學(xué)活性的物質(zhì)成為本次研究的首選。而人核心蛋白聚糖(decorin，DCN)正是這樣一種物質(zhì)，它作為一種已知的天然內(nèi)源性TGF－β阻斷劑而具有抗纖維化效果。從上世紀(jì)90年代初起，DCN在眼科領(lǐng)域也開(kāi)展了相關(guān)研究，主要集中于角膜的研究［6］。目前，尚未對(duì)翼狀胬肉進(jìn)行相關(guān)的研究，本實(shí)驗(yàn)選擇體外培養(yǎng)的人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞(human pterygium fibroblasts，HPF)作為研究對(duì)象，探討TGF－β抑制劑DCN對(duì)其增殖和凋亡的影響，并與傳統(tǒng)藥物絲裂霉素進(jìn)行比較，為其用于翼狀胬肉的治療和術(shù)后預(yù)防復(fù)發(fā)提供前期實(shí)驗(yàn)資料。

材料和方法

1 主要試劑

DCN(R＆D)，絲裂霉素 C(mitomycin C，MMC;華北制藥公司)，小鼠抗人角蛋白及波形蛋白單克隆抗體(Santa Cruz)，小鼠抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單克隆抗體(Santa Cruz)，SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

2 標(biāo)本來(lái)源

共收集本院15例初發(fā)期翼狀胬肉患者的手術(shù)標(biāo)本，其中男性9例，女性6例，年齡49～58歲。

3 主要方法

3．1 HPF的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng) 利用組織塊培養(yǎng)法采用含200 mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于溫箱中。待原代貼壁培養(yǎng)生長(zhǎng)至基本匯滿(mǎn)培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)用2．5 g/L的胰酶消化，按1∶2繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取第3或第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。制備細(xì)胞爬片，SP法染色進(jìn)行鑒定。

3．2 DCN及MMC對(duì)HPF增殖的影響 在傳代至第3或4代的HPF(貼壁24 h后)中加入DCN，并以MMC為對(duì)照，10 mg/L培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后在相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞分布及形態(tài)學(xué)變化。吸去上清，各孔加MTT 20μL，孵育4h，加120μL DMSO，振蕩后用酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處吸光度值(A)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率(inhibitory rate，IR)(%)=(陰性對(duì)照組平均A值－處理組平均A值)/陰性對(duì)照組平均A值×100%。

3．3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCN對(duì)細(xì)胞周期分布及凋亡情況 待HPF傳代至第3或第4代，取不同濃度的DCN(0．01、0．1、1、5、10 mg/L)分別處理 48 h 后的實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組(不加藥)細(xì)胞懸液，每組各4瓶標(biāo)本，PBS洗滌2次后離心，棄上清，加入70%冷乙醇，吹打成單細(xì)胞懸液后加入70%冷乙醇固定過(guò)夜，離心后棄上清，PBS洗滌2次，加入0．2 mg/L RNA酶50 mL，放入37℃恒溫箱30 min，碘化丙啶(PI)染色，4 h內(nèi)用FACS－420流式細(xì)胞儀(BD)檢測(cè)，選用488 nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定樣本。

3．4 檢測(cè)DCN對(duì)細(xì)胞表達(dá)PCNA的影響 待HPF傳代至第3或第4代，將細(xì)胞懸液接種于鋪有蓋玻片(按細(xì)胞培養(yǎng)用品清洗和高壓滅菌)的6孔板中，孵育24 h后分為A、B 2組，A組為對(duì)照組，B組為DCN 組(0．01、0．1、1、5、10mg/L)，孵育 48 h 后取出蓋玻片，經(jīng)免疫組織化學(xué)SP法染色(同前)檢測(cè)PCNA的表達(dá)。結(jié)果分析采用比較PCNA標(biāo)記指數(shù)(labeling index，LI)，即平均每100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。計(jì)算6個(gè)視野(放大倍率20×10)的全部陽(yáng)性細(xì)胞及陰性細(xì)胞并列表，將計(jì)數(shù)資料進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13．0軟件作統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間差異性比較用單因素方差分析，細(xì)胞數(shù)量與吸光度值(A值)關(guān)系采用相關(guān)分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HPF免疫組織化學(xué)鑒定

體外培養(yǎng)的HPF經(jīng)SP法染色可見(jiàn)波形蛋白表達(dá)陽(yáng)性，位于胞漿，呈現(xiàn)與成纖維細(xì)胞長(zhǎng)軸方向一致棕黃色束狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);細(xì)胞角蛋白表達(dá)陰性，見(jiàn)圖1。

2 HPF生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

對(duì)照組曲線(xiàn)可明顯區(qū)分為指數(shù)增長(zhǎng)期(接種后2～6 d)和平臺(tái)期(6 d以后)，而用藥組曲線(xiàn)下移，上升緩慢，趨于低平，無(wú)明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期和平臺(tái)期，在用藥5～6 d吸光度達(dá)峰值，以后逐漸下降，見(jiàn)圖2。

3 不同濃度DCN及MMC對(duì)HPF的增殖抑制作用

Figure 1．Identification of human pterygium fibroblasts(immunocytochemical staining，×100)．A:positive expression of vimentin;B:negative expression of keratin．圖1 人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的鑒定

Figure 2．Growth curves of human pterygium fibroblasts from day 1 to day 8．ˉx±s．n=15．圖2 1～8 d人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2組藥物隨濃度增加，其抑制作用增強(qiáng)，并呈劑量依賴(lài)性，見(jiàn)表1～3。DCN組不同濃度的抑制率均低于MMC組，尤其是當(dāng)DCN藥物濃度低時(shí)，即＜1 mg/L，其抑制作用不明顯，當(dāng)濃度＞1 mg/L時(shí)，其抑制作用增強(qiáng)增快。MMC組:隨時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞可出現(xiàn)毒性反應(yīng)，可見(jiàn)細(xì)胞碎裂、崩解，有活性的細(xì)胞數(shù)逐漸減少。DCN組:藥物作用后隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯減少，無(wú)細(xì)胞碎裂、崩解，活性細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，極少部分細(xì)胞貼壁性變差，形成團(tuán)塊狀。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度DCN對(duì)HPF細(xì)胞周期的影響

1～10 mg/L DCN使 G0/G1期細(xì)胞顯著增多(P＜0．05)，5～10 mg/L DCN使S期細(xì)胞下降顯著(P＜0．05)，沒(méi)有檢測(cè)到終末期凋亡細(xì)胞。增殖率G2/M%+S%反映了細(xì)胞增殖能力，5～10 mg/L DCN使 G2/M%+S%顯著下降(P＜0．05)，表明細(xì)胞增殖能力下降，見(jiàn)表4。

5 DCN對(duì)細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響

細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)顯示為棕黃色、黃色或淺黃色細(xì)小均勻顆粒，分布于整個(gè)細(xì)胞核;細(xì)胞核無(wú)著色、胞漿呈淡黃色者為陰性。1～10 mg/L DCN組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組差異非常顯著。PCNA標(biāo)記指數(shù)隨著藥物濃度增加而遞減，說(shuō)明DCN對(duì)HPF PCNA的表達(dá)有明顯影響并具有濃度依賴(lài)性，見(jiàn)表5。

表1 12 h不同濃度DCN及MMC對(duì)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的抑制作用Table 1．The inhibitory effects of DCN and MMC on human pterygium fibroblasts treated for 12 h(ˉx±s．n=15)

表2 24 h不同濃度DCN及MMC對(duì)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的抑制作用Table 2．The inhibitory effects of DCN and MMCon human pterygium fibroblasts treated for 24 h(ˉx±s．n=15)

表3 48 h不同濃度DCN及MMC對(duì)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的抑制作用Table 3．The inhibitory effects of DCN and MMCon human pterygium fibroblasts treated for 48 h(ˉx±s．n=15)

表4 不同濃度DCN作用48 h對(duì)細(xì)胞周期時(shí)相的影響Table 4．Changes of cell cycle of human pterygium fibroblasts treated with DCN at different doses for 48 h(%．ˉx±s．n=15)

表5 不同濃度DCN作用48 h對(duì)細(xì)胞PCNA表達(dá)的影響Table 5．Changes of PCNA expression in human pterygium fibroblasts treated with DCN at different doses for 48 h

討 論

DCN作為T(mén)GF－β1的天然抑制劑，具有抗纖維化及抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的兩大特性，已被視為對(duì)器官纖維化及腫瘤具有良好治療前景的藥物。研究發(fā)現(xiàn)，DCN除了可干擾轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF－β與其受體的結(jié)合而中和其活性從而具有減輕組織纖維化的作用外，還可修飾膠原蛋白鏈而調(diào)節(jié)膠原的合成，與纖連蛋白(FN)和血小板反應(yīng)蛋白－1(TSP－1)結(jié)合從而起到抗黏附、抑制細(xì)胞與FN和TSP－1基質(zhì)結(jié)合、調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生、轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)的作用。DCN單獨(dú)或與TSP－1結(jié)合能干擾細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞受體的激活，從而阻斷細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起的細(xì)胞骨架重構(gòu)、遷移和管樣結(jié)構(gòu)的形成［6］。另外，DCN還能與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)結(jié)合［7］，CTGF也是致纖維化因子之一。

DCN抑制包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是:(1)DCN能夠與TGF－βⅠ、Ⅱ、Ⅲ型受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合TGF－β，DCN與TGF－β具有高親和力，DCN結(jié)合TGF－β成為無(wú)活性的復(fù)合物。一定劑量的DCN能使TGF－β1、TGF－β2和 TGF－β3活性降低，阻斷 TGF－β1、TGF－β2和 TGF－β3與相應(yīng)的TGF－β受體結(jié)合。(2)DCN可以與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)互相作用，使其磷酸化，從而引起絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)的活化，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員和細(xì)胞周期素依賴(lài)性抑制物p21表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。p21是周期素依賴(lài)性蛋白激酶(CDK)強(qiáng)抑制因子，在不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞研究中也證實(shí)DCN抑制細(xì)胞生長(zhǎng)是通過(guò)誘導(dǎo)p21表達(dá)［8］。(3)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，可能激活蛋白激酶C信號(hào)通路。DCN可以上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，并可被EGFR的特異性阻斷劑抑制，提示DCN與EGFR結(jié)合后通過(guò)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度而激活蛋白激酶C信號(hào)途徑［9］。(4)DCN還可能通過(guò)抑制腫瘤血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用。Grant等［9］研究證實(shí)，野生型腫瘤細(xì)胞的分泌物刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移、分化及出芽過(guò)程，而DCN則可抑制這些過(guò)程;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則表明，將表達(dá)DCN的腫瘤細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)，腫瘤的生長(zhǎng)及血管的生成速度明顯減慢，我們還證實(shí)DCN的此作用與其抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)及分泌有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的HPF進(jìn)行觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)第2～6代HPF細(xì)胞增殖旺盛，傳至第7代時(shí)，表明細(xì)胞開(kāi)始向其它細(xì)胞類(lèi)型發(fā)生轉(zhuǎn)變，為保證細(xì)胞活性的一致性，實(shí)驗(yàn)均采用第3～4代 HPF，觀(guān)察10 mg/L DCN、MMC 分別在24 h、48 h、72 h 對(duì)翼狀胬肉成纖維細(xì)胞的影響發(fā)現(xiàn)，等濃度的2種藥物比較，DCN對(duì)細(xì)胞形態(tài)的改變遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MMC。

用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，1～10 mg/L DCN濃度 G0/G1期的細(xì)胞比率增高(P＜0．05)，5～10 mg/L DCN使S期的細(xì)胞下降(P＜0．05)，表明DCN可以延緩細(xì)胞由G1期向S期的過(guò)渡，提示DCN可能影響細(xì)胞周期，使HPF多數(shù)停滯于DNA合成前期，表明DCN可能抑制、干擾DNA合成，使細(xì)胞的倍增時(shí)間延長(zhǎng)。沒(méi)有檢測(cè)到終末期凋亡細(xì)胞的結(jié)果表明DCN對(duì)HPF細(xì)胞增殖的抑制可能是使得細(xì)胞停滯在DNA合成前期，而并不影響細(xì)胞凋亡。G2/M%+S%反映了細(xì)胞增殖能力，5～10 mg/L DCN使G2/M%+S%顯著下降(P＜0．05)，表明細(xì)胞增殖能力下降。

PCNA是一種核內(nèi)蛋白，是DNA復(fù)制時(shí) δ聚合酶的輔助物，其出現(xiàn)與細(xì)胞增殖有明顯關(guān)系，直接參與核內(nèi)DNA的合成，主要表達(dá)在細(xì)胞增殖周期的S期，被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、并且可直接了解細(xì)胞增殖狀況的研究指標(biāo)。通過(guò)免疫組化方法對(duì) PCNA表達(dá)的檢測(cè)，揭示 DCN可通過(guò)間接抑制 DNA復(fù)制而達(dá)到其抗增殖作用。經(jīng)DCN作用后，HPF中PCNA的表達(dá)下降，表明 HPF增殖減慢，生長(zhǎng)受到抑制，與MTT和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果一致。

目前通過(guò)基因克隆技術(shù)也已成功獲得DCN［10］。從組織中提取天然DCN有廣泛的來(lái)源和技術(shù)上的可行性。鑒于DCN明顯抑制纖維化和強(qiáng)的抗腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移活性，加之其由人體產(chǎn)生、不具免疫原性、取材廣泛、可通過(guò)基因工程規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，DCN被視為對(duì)器官纖維化及腫瘤具有良好治療前景的藥物。盡管如此，但目前尚存許多問(wèn)題還沒(méi)有解決，如DCN對(duì)不同組織不同細(xì)胞，其作用不盡相同，濃度大小作用也不盡相同，國(guó)內(nèi)外有關(guān)DCN文獻(xiàn)報(bào)道其有效工作濃度基本上都是在 mg/L水平，0．01mg/L DCN可刺激正常肝細(xì)胞及肝星形細(xì)胞的增殖;5～10 mg/LDCN則具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。而小劑量的DCN對(duì)肝癌細(xì)胞系HuH7即有明顯的抑制效果［11］。因此只有不斷探索，深入研究，才能對(duì)其應(yīng)用前景得出肯定的結(jié)論。本文采用的是0．01～10mg/L范圍濃度，當(dāng)DCN藥物濃度低時(shí)，即＜1mg/L，其抑制作用不明顯，當(dāng)濃度＞1mg/L時(shí)，其抑制作用增強(qiáng)增快。

綜上所述，本研究從不同角度證實(shí)DCN具有很強(qiáng)的抗增殖作用，且在一定藥物終濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴(lài)性，提示 DCN有可能成為新型抗增殖藥物，并具有廣泛的來(lái)源和技術(shù)上的可行性。但尚須進(jìn)一步研究和確認(rèn)其抗增殖作用的機(jī)制。鑒于藥物作用在體內(nèi)外具有一定的差異，我們將進(jìn)一步觀(guān)察和研究DCN對(duì)動(dòng)物活體眼的藥效及毒性反應(yīng)，以便確定有效治療濃度和最佳給藥途徑，為治療和預(yù)防翼狀胬肉的復(fù)發(fā)尋找新方法。

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