張定國，黃先忠，東銳，鄭銀英，崔百明

（石河子大學生命科學學院／農業(yè)生物技術重點實驗室，石河子832003）

FT（Flowering Locus T）基因是光周期途徑中決定植物開花的重要因子。CO和FT基因在植物開花中起著關鍵作用，CO基因在長日照下能夠誘導葉片FT基因的表達，當FT基因在莖尖特異表達時可以促進花芽分化。FT蛋白（誘導開花的成花素信號分子）從葉片經過韌皮部長距離運輸到達莖頂端分生組織后，與頂端組織特異表達的Flowering Locus D（FD）基因編碼產物之間結合，形成一種蛋白復合體，共同促進下游成花基因Apetala 1（AP1）、Leafy（LFY）等的表達，從而促進植物開花［1］。棉花Gh FTL1基因已經被克隆，系統(tǒng)進化分析表明Gh FTL1屬于FT亞家族成員［2］。

染色體步移技術（Genome walking）是一種重要的分子生物學研究技術，使用這種技術可以有效獲取與已知序列相鄰的未知序列。熱不對稱交錯PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAILPCR）技術［3］因快速、簡單、高效等優(yōu)點而備受青睞，目前已有大量成功報道［4］。Wang 等［5］利用 TAIL－PCR法分離了小球藻硝酸還原酶基因5′端側翼序列，將其與GUS基因融合并表達，結果顯示該側翼序列能啟動GUS基因的表達，該片段含有硝酸還原酶基因轉錄表達所必要的啟動子元件。財音青格樂等［6］通過此方法，成功地克隆了大豆種子特異性啟動子序 列 （約 700 bp）。李 秋 莉 等［7］也 應用TAIL－PCR法成功地克隆了遼寧堿蓬BADH基因的啟動子片段。Liu等［8］報道，TAIL－PCR 方法通?？梢詳U增到0.2～2.0 kb的片段。因此，TAILPCR法是克隆未知啟動子的一種有效、簡便的方法。

本實驗室已經獲得GhFTL1基因的序列［2］，為了研究Gh FTL1基因自身啟動子的功能，利用TAIL－PCR方法從棉花基因組中分離了長度為715 bp的該基因序列片段，并對已得到的序列片段序列進行分析，旨在為進一步研究該啟動子的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1植物材料

實驗材料為新疆陸地棉品種新陸早33。

1.1.2菌株和質粒

大腸桿菌DH5α、根癌農桿菌GV3101、植物表達載體pCAMBIA1301、p35S：：Gh FTL1為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

棉花DNA提取采用CTAB法。

1.2.2引物的設計及合成

根據已知棉花FT同源（登錄號HM631972）基因的序列，設計引物（華大基因合成）（表1）用作PCR擴增。

表1 TAIL－PCR引物Tab.1 Primers of TAIL－PCR

1.2.3 pGhFTL1啟動子片段的克隆

TAIL－PCR第1輪擴增：以棉花葉片DNA為模板，在50μL的反應體系中加入DNA模板2μL，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5U LA Taq DNA聚合酶，以AD1為正向引物，SP1為反向引物各1μL，dd H2O補齊。第2輪擴增：將第1輪PCR反應液稀釋100倍后，取1μL作為第2輪PCR反應的模板，5μL 10×LA Buffer，8μL d NTP Mixture，0.5μL 5 U LA Taq DNA聚合酶，以AD1為正向引物，SP2為反向引物各1μL，dd H2O補齊。第3輪擴增：將第2輪PCR反應液稀釋100倍后，取1μL作為第3輪PCR反應的模板，反應體系與第2輪的相同。取上述各步PCR反應液在1%的瓊脂糖凝膠上檢測，割下目的條帶，利用凝膠回收試劑盒純化后，將回收產物與載體p GEM－T Easy連接。連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，在涂有IPTG／X－gal及氨芐抗生素的LB平板上通過藍白斑篩選，挑取陽性克隆于LB培養(yǎng)基中過夜搖菌，小量提取質粒經酶切鑒定后，將陽性克隆交由北京華大基因公司測序。

第1輪反應程序：94℃1 min，98℃1 min 1個循環(huán)；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 5個循環(huán)；94℃30 s，25℃3 min，72℃2 min 1個循環(huán)；94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個循環(huán)；72℃10 min 1個循環(huán)。

第2輪反應程序：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個循環(huán)；72℃10 min 1個循環(huán)。

第3輪反應程序：同第2輪反應程序。

1.2.4 GhFTL1啟動子的驗證

為了驗證所克隆的片段是GhFTL1的啟動子，從已克隆的啟動子片段中設計2個引物P－Jian－F－1：5′－TGGGGTGTGTATGCAGTTGT－3′，P－Jian－F－2，5′－GAATCACAGAAAG GGCAAGC－3′分 別和TAIL－PCR中所用到的SP1引物進行PCR驗證，以棉花葉片DNA為模板，在10μL反應體系中加入DNA模板0.5μL，1μL 10×Hotmaster Buffer，1μL d NTP Mixture，0.1μL 2.5 U Hotmaster Taq DNA 聚合酶，以 P－Jian－F－1和 P－Jian－F－2為正向引物，SP1為反向引物各0.5μL，dd H2O補齊。

PCR反應程序為：94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，61℃1 min，72℃2 min 94℃30 s，44℃1 min，72℃2 min 15個循環(huán)；72℃10 min 1個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 GhFTL1啟動子片段的克隆與測序

利用引物 AD1、AD2、AD3和SP1、SP2、SP3分別進行3組3輪PCR，第3輪擴增出約為800 bp的產物（圖1），將第3輪PCR產物回收純化后連接到p GEM－T載體上，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆提取質粒經EcoRⅠ酶切鑒定（圖2）。挑選其中陽性克隆進行測序，將800 bp的測序結果經DNAstar軟件分析，和已知的FT序列比對，該序列確實為Gh FTL1上游啟動子序列。

圖1 Genome Walking PCR方法經過三輪擴增后PCR片段Fig.1 PCR fragments amplified by using genome Walking PCR

圖2 pGEM－T載體上的質粒酶切鑒定Fig.2 The restriction enzyme digestion analysis of pGEM－T vector

2.2 GhFTL1啟動子的驗證

從已克隆的啟動子片段中設計2個引物，分別與TAIL－PCR中所用到的SP1引物進行PCR驗證。將PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳結果（圖3）與預期結果一致。

圖3 PCR驗證啟動子Fig.3 PCR validation promoter

2.3 GhFTL1啟動子序列分析

通過TAIL－PCR，獲得715 bp的啟動子片段，經Program NSITE（Softberry Inc.）序列分析表明，在該片段起始密碼子104 bp處有1個典型的TATA box，預測的轉錄起始位點在起始密碼子前69 bp處，除了有TATA box、CAAT box等基本元件外，還含有與光調節(jié)有關的元件，GT－1和SP1，另外還有如 CAr G box、GT－1＃Box7、telo－box、GS1b AC box 1等其他一些元件（圖4）以及逆境脅迫相關等的順式作用元件，通過同源克隆法先后從小擬南芥中克隆了一些耐逆基因，這些基因的啟動子中有許多逆境脅迫元件［9－11］。

植物開花受環(huán)境因素和發(fā)育狀態(tài)的控制，在擬南芥中幾種開花信號，包括光周期應答，集中在FT基因的轉錄調節(jié)水平上。當擬南芥FT在長日照條件的誘導下FT在葉片的維管組織中轉錄，幾種轉錄抑制子參與了FT的調節(jié)，盡管這些元件對FT調節(jié)的重要性沒有完全得到證明，但FLC的MADS box與SVP形成的復合物與FT啟動子近端區(qū)域和包含有CAr G boxe的第1個內含子有一定的聯系［12］。FT的表達受FLC表達的抑制，這種抑制受FT啟動子的介導，在FT的啟動子中有1個CArG box。擬南芥FT基因編碼的蛋白產物是可以長距離轉運的成花激素，可從葉片運輸到芽頂端，優(yōu)先在芽頂端表達的FD，對FT促進開花是必需的，FD和FT通過蛋白互作，激活花分生組織特異性基因AP1，從而促進開花［13］。

GT元件是一個光應答元件。GT元件最初是在豌豆葉片rbcS－3A基因啟動子中被鑒定出來，其核心序列為5′－GTGTGGTTAATATG。GT－1是一種蛋白，其可與光調節(jié)基因的啟動子相互作用，分布在cab－E啟動在的7個不同為點上。在cab－E基因的啟動子內GT－motifs是通過GT－1把他們結合在一起，rbcS－3A基因啟動子與GT－1的結合位點序列和cab－E基因的啟動子與GT－1的結合位點序列一致［14］。紫外光能能增強Tdc啟動子的表達，通過紫外光證明了GT－1在Tdc中調節(jié)的功能。PsGS1b在整個植物的維管組織中表達，在不同的新陳代中銨鹽的重新利用中起重要作用，還可在酵母、擬南芥和松樹的細胞中激活轉錄［15］。分析了PsGS1b的啟動子的403 bp的序列在該啟動子轉錄起始位點上游的1個區(qū)域含有大量的AC元件，這個區(qū)域被稱為GS1b AC box 1，其包含3種AC元件，AC元件能調節(jié)基因的表達［16］。siteⅡ和telobox是一種順式調節(jié)元件，與基因的分生表達有關。細胞循環(huán)的眾多基因啟動子中siteⅡ和telo－box之間存在保守關聯，包括幾種細胞循環(huán)有關的基因和編碼核糖體蛋白的擬南芥153基因。植物在擬南芥啟動siteⅡ元件的控制下可觀測到GUS基因的分生表達，而啟動子中的telo－box能增強這一表達。telo－box在擬南芥中編碼延長因子基因的啟動子中首次被觀測到，后來在幾種植物的RP啟動子中也發(fā)現了這一元件［17］，已經確定telo－box可激活細胞循環(huán)中一組基因的誘導表達或過量表達［18］。telobox不能完全依賴自身來激活基因的表達，但要同其他順式激活序列協同作用才能發(fā)揮作用。因此，初步推斷此序列片段可能是Gh FTL1基因的啟動子。

圖4 pGhFTL1啟動子的序列分析Fig.4 Sequence analysis of Cotton pGhFTL1 gene promoter

3 結論與討論

在轉基因棉工程中，有關啟動子在棉花中的研究較多，但是大多數采用組成型啟動子。其中所應用的表達載體基本上是利用外源型啟動子Ca MV 35S。Tail－PCR、SiteFinding－PCR 等克隆技術的發(fā)展，加快了啟動子克隆的進程。近年來，世界各國正在加快棉花基因組的測序，并且隨著克隆方法的不斷改進，棉花基因組中各種類型的啟動子已被大量克隆測序，其功能也在一定程度上得到驗證。在棉花基因工程研究中，除利用外源啟動子外，越來越多的棉花內源啟動子被開發(fā)出來，利用棉花內源啟動子本身的特性來改良基因在棉花中的表達。

TAIL－PCR技術［13］因快速、簡單、高效等優(yōu)點而備受青睞，本實驗采用TAIL－PCR方法克隆了Gh FTL1啟動子片段。特異性引物設計基本遵循一般PCR 引物設計原則［18］，為了提高 TAIL－PCR擴增的特異性，本實驗進行了兩處重要改進：1）3條特異引物退火溫度均高于60℃，低于72℃，且3條特異引物sp1、sp2、sp3退火溫度依次升高，使第1輪及第2輪TAIL－PCR中的非特異擴增片段不能進一步有效擴增，進而提高終產物擴增的特異性；2）特異性引物3′末端5～10個堿基中適當提高G、C含量，尤其是3′末端5個堿基設計時不要出現二聯體或三連體的A或T，同時增加G或C堿基的個數，這樣可大幅減少特異引物的自身非特異擴增。本實驗采用改良的TAIL－PCR法取代5′RACE方法分離基因的5′端序列，為全長基因克隆提供了一種新選擇。改良后的TAIL－PCR技術很大程度地彌補了原TAIL－PCR技術非特異擴增高、成功率低的缺陷，通過隨機引物的篩選及特異引物設計的改進，極大地提高了TAIL超級循環(huán)中特異擴增的效率，操作簡單，3輪超級循環(huán)在1 d內就可完成，因此該技術省時省力、快速高效。改良后的TAIL－PCR技術對試劑、儀器等的要求相對較低，一般實驗室均可滿足要求，因此該技術是進行全長基因克隆的理想選擇，具有較廣闊的應用前景。

對克隆的啟動子片段進行序列分析，在此啟動子上不僅含有TATA box和CAAT box基本元件，而且含有與光調節(jié)有關的元件，如GT－1和SP1，另還外存在一些其他元件，在該片段在起始密碼子104 bp處有1個典型的TATA box，預測的轉錄起始位點在起始密碼子前69 bp處。

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