董 迪，朱艷華，何自福，柴兆祥，佘小漫，羅方芳

(1 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，廣東廣州 510640;2 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

雙生病毒科Geminiviridae菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus病毒是一類由煙粉虱Bemisia tabaci以持久方式傳播的單鏈DNA病毒［1］，已在以色列、巴基斯坦、印度、美國、中國、非洲和加勒比海等多個國家和地區(qū)的番茄、棉花、木薯和菜豆等多種作物上造成毀滅性危害.近年來，我國廣西、云南、廣東、江蘇和浙江等地的番茄［2-5］、煙草［6］、番木瓜［7］和朱槿［8］等作物上先后發(fā)現(xiàn)多種該屬病毒的嚴重為害.

黃秋葵Abelmoschus esculentu(L.)Moench又名羊角豆和秋葵等，屬錦葵科秋葵屬，生長于熱帶、亞熱帶和地中海氣候地帶，在印度、巴基斯坦、美國、埃及、尼日利亞、希臘和土耳其等國廣泛種植，是一種深受歡迎的蔬菜作物.黃脈花葉病或曲葉病是黃秋葵生產(chǎn)上主要病害，由黃秋葵黃脈花葉病毒(Okra yellow vein mosaic virus，OYVMV)、秋葵黃脈花葉病毒(Bhendi yellow vein mosaic virus，BYVMV)、黃秋葵曲葉病毒(Okra leaf curl virus，OkLCV)、杰濟拉棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Gezira virus，CLCuGV)或木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMV)等侵染引起，其中OYVMV和BYVMV是生產(chǎn)上最主要制約因子［9-10］.上述這些病毒均屬菜豆金色花葉病毒屬.

近年來，中國大陸從中國臺灣及日本引進黃秋葵種植.目前，在廣東、北京、上海、山東、江蘇、浙江、海南和福建等地均有栽培.2008年，筆者首次在廣東省廣州市花都區(qū)蔬菜基地發(fā)現(xiàn)黃秋葵黃脈曲葉病.PCR檢測［11］及室內(nèi)煙粉虱傳毒試驗均證明病株中存在菜豆金色花葉病毒屬病毒.為了明確侵染引起廣東黃秋葵黃脈曲葉病的病原病毒種類，以及進一步防治該病害提供依據(jù)，我們對該病毒代表分離物的基因組進行了克隆與序列分析.

1 材料與方法

1.1 毒源

黃秋葵黃脈曲葉病樣采自廣東省廣州市花都區(qū)花東蔬菜基地.以室內(nèi)介體煙粉虱傳毒獲得的病毒分離物Okra06作為毒源進行基因克隆.

1.2 DNA 提取

采用 2%CTAB 法［12］提取病株總 DNA，作為PCR模板.

1.3 PCR擴增、克隆和序列測定

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物AV494和CoPR［13-14］進行 PCR 擴增，獲得 DNA-A 上570 bp大小的片段，將該片段進行克隆、序列測定和比較分析.根據(jù)該片段序列又設(shè)計了1對特異引物OPL1(5'-accaggaatcacacgaattcggtc-3')和OPR1(5'-accgacaccacgagtaacatcaga-3')，用于擴增DNA-A近全長序列，將PCR特異片段進行克隆、測序與分析.

應(yīng)用菜豆金色花葉病毒屬病毒衛(wèi)星分子DNA β特異引物 β01 和 β02［15］，PCR 擴增獲得 DNA β 全長序列，進行克隆和序列測定;再根據(jù)測得的序列設(shè)計1對反向引物 β03(5'-gacccaaacactttcaacccatta-3')和β04(5'-atttgatgagcgatggtgacttgg-3')，擴增包括引物β01和β02序列區(qū)在內(nèi)約1000 bp的片段，加以驗證.

上述各PCR產(chǎn)物分離純化后，分別克隆到pMD-18T載體［寶生物工程(大連)有限公司］上，隨機各挑選3個克隆進行序列測定.引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成.

1.4 序列分析

通過上述方法分別獲得分離物Okra06的DNAA和DNA β全長序列.利用BLAST程序在GenBank中對這2個序列進行相似性檢索，利用 DNAStar MegAlign 5.01(DNASTAR Inc.)Clustal W 方法進行多序列比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵黃脈曲葉病癥狀

病株表現(xiàn)為矮化，病株葉片向上或向下卷曲、葉背面葉脈呈網(wǎng)狀突起，對著光可見其葉支脈呈墨綠色或存在墨綠色的線條(圖1A、1B).病株后期，葉片從邊緣開始逐步退綠黃化，葉正面的葉脈黃化明顯、背面葉脈腫大(圖1C、1D).

2.2 病毒分離物Okra06基因組DNA-A全序列及特征

圖1 黃秋葵黃脈曲葉病癥狀Fig.1 The symptoms of okra yellow vein and leaf curl disease

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物AV494和CoPR，從病毒分離物Okra06病株總DNA中PCR擴增獲得1條預(yù)期大小的DNA片段.序列分析顯示，該片段長為570 bp;在GenBank中，與其有較高相似性的均為菜豆金色花葉病毒屬病毒，其中與CLCuMV分離物G6［8］的相似性最高(99%)，說明分離物Okra06也應(yīng)屬菜豆金色花葉病毒屬.為此，根據(jù)該片段序列，又設(shè)計了一對特異引物OPL1和OPR1，PCR擴增出一條預(yù)期大小約2600 bp DNA片段，健康對照未擴增出任何片段.序列測定結(jié)果顯示，該片段長為2614 bp.上述2個DNA片段序列重疊部分核苷酸序列完全一致，拼接后得到分離物Okra06的DNA-A全序列長為2737 nt(GenBank登錄號:FJ770370).

Okra06 DNA-A具有菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組典型特征，為閉合環(huán)狀單鏈DNA，推導(dǎo)編碼6個ORFs，分別是病毒鏈上的AV1基因(位于276～1046 nt)、AV2基因(位于116～481 nt)以及互補鏈上的AC1基因(位于1495～2586 nt)、AC2基因(位于1146～1598 nt)、AC3基因(位于1049～1453 nt)和AC4基因(位于2127～2429 nt)，在AV2與AC1之間有266 nt(位于2587～115 nt)的基因間隔區(qū)(Intergenic region，IR)，該區(qū)域中含有病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需的調(diào)控元件，包括11 nt莖和11 nt環(huán)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(2717～13 nt)，保守的TAATATTAC序列.

2.3 分離物Okra06 DNA-A與其他雙生病毒的相似性比較結(jié)果

BLAST檢索結(jié)果表明，GenBank中與分離物Okra06 DNA-A有同源關(guān)系的序列均屬菜豆金色花葉病毒屬病毒，其中相似性較高的病毒共有15種49個分離物或株系(表1)，它們分別是可侵染棉花的CLCuMV、CLCuGV、拉賈斯坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRV)、布里瓦拉棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Burewala virus，CLCuBuV)、班加羅爾棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Bangalore virus，CLCuBV)和阿拉巴德棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Alabad virus，CLCuAV)等6種病毒，以及可侵染黃秋葵或秋葵的 CLCuGV、OYVMV、OkLCV、BYVMV、黃秋葵黃化皺縮病毒(Okra yellow crinkle virus，OYCrV)、伊瓜拉黃秋葵黃斑駁病毒(Okra yellow mottle Iguala virus，OYMIV)、黃秋葵斑駁病毒(Okra mottle virus，OkMoV)、德里秋葵黃脈病毒(Bhendi yellow vein Delhi virus，BYVDV)、布巴內(nèi)斯瓦爾秋葵黃脈病毒(Bhendi yellow vein Bhubhaneswar virus，BYVBV)和哈里亞納秋葵黃脈病毒(Bhendi yellow vein Haryana virus，BYVHV)等10 種病毒.

分離物Okra06與上述49個病毒分離物DNA-A全序列比較結(jié)果顯示:Okra06與CLCuMV 17個分離物DNA-A的相似性均大于89%，其中與分離物G6的相似性最高，為 99.7%;二者 AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和 AC4基因的相似性分別為 100%、100%、99.6%、99.8%、100%和99.7%，即使菜豆金色花葉病毒屬基因組中最易變異的IR區(qū)相似性也達98.9%，推導(dǎo)編碼的6個蛋白質(zhì)氨基酸序列相似性為99.0% ～100%.除與 CLCuRV－［Sirsa:04］和OYCrV－［Cameroon］的相似性為89.0%外，Okra06與 CLCuRV(Abohar、Sri)、CLCuBuV、CLCuAV、BYVMV、OYVMV、CLCuBV、BYVDV、BYVHV 和BYVBV等9個病毒22個分離物的相似性僅為77.4% ～86.3%，而與 OYCrV －［Mali］、CLCuGV、OYMIV、OkLCV及OkMoV等5個病毒8個分離物的相似性均小于70%(63.1% ～69.0%)(表1).

2.4 衛(wèi)星分子DNA β結(jié)構(gòu)及相似性比較結(jié)果

應(yīng)用菜豆金色花葉病毒屬病毒衛(wèi)星分子DAN β的特異引物 β01和 β02，從分離物 Okra06病株總DNA中PCR擴增獲得一條1321 bp DNA片段，而健康對照無任何擴增片段，克隆測序后得到該片段序列.相鄰反向引物β03和β04 PCR擴增獲得的特異片段長為1026 bp，該片段與β01/β02擴增獲得的片段序列重疊，二者除2 bp差異(由引物β01和β02引入，位于引物近5'端)外，其余序列完全一致.因此，拼接后獲得Okra06 DNA β全長序列為1346 nt(GenBank登錄號為:FJ770371).

該序列為閉合環(huán)狀單鏈DNA，推導(dǎo)在其互補鏈上有一個ORF(位于193～549 nt)，編碼含118個氨基酸的C1蛋白，在764～994位核苷酸之間富含A，在1246～15位核苷酸之間含有一個長為115 nt的保守區(qū)域(Conserved region，CR)，CR區(qū)含有雙生病毒科病毒共有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和TAATATTAC序列.

表1 Okra06與49個菜豆金色花葉病毒屬病毒分離物或株系DNA-A及各基因編碼的氨基酸序列相似性比較1)Tab.1 Percentages of nucleotide or amino acid sequences identities between Okra06 and 49 isolates of begomoviruses %

BLAST檢索及序列相似性比較表明，Okra06 DNA β與伴隨菜豆金色花葉病毒屬10種36個DNA β衛(wèi)星分子的相似性較高，其中與CLCuMV－［G6］DNA β序列相似性最高(為99.5%)，與CLCuMV－［Gx08］DNA β相似性也達到 99.3%;與伴隨CLCuMV的其他12個DNA β及伴隨CLCuV的8個DNA β相似性為82.6% ～92.2%;而與侵染黃秋葵或秋葵的 BYVMV、OYVMV、OkLCuMV、OkLCV、CLCuGV等5種病毒伴隨的7個DNA β相似性僅有48.9% ～58.7%.該衛(wèi)星分子與CLCuMV－［G6］編碼的C1氨基酸相似性也是最高，為100%.CR是DNA β中最保守的區(qū)域，Okra06與伴隨CLCuMV、CLCuV、CLCuBuV、新德里番茄曲葉病毒(Tomato leaf curl New Delhi virus，ToLCNDV)、玫瑰茄黃脈花葉病毒(Mesta yellow vein mosaic virus，MYVMV)和云南賽葵黃脈病毒(Malvastrum yellow vein Yunnan virus，MaYVV)等6種病毒的26個DNA β的CR相似性均大于88.9%;但與伴隨侵染黃秋葵或秋葵的OYVMV等5種病毒7個DNA β的CR相似性均不超過44.5%.

系統(tǒng)進化關(guān)系分析結(jié)果顯示，Okra06 DNA β與CLCuMV －［G6］DNA β、CLCuMV － ［Gx08］DNA β親緣關(guān)系最近，三者形成一個獨立分支;進一步與其他12個CLCuMV DNA β 及8個CLCuV DNA β 聚類在一起，而與侵染黃秋葵或秋葵的 BYVMV、OYVMV、OkLCuMV等病毒的DNA β親緣關(guān)系均相對較遠(圖2).

圖2 Okra06 DNA β與伴隨菜豆金色花葉病毒屬病毒36個DNA β的系統(tǒng)關(guān)系樹Fig 2 Phylogenetic tree of DNA β of Okra06 and 36 other Begomoviruses

3 討論與結(jié)論

對來自廣東黃秋葵黃脈曲葉病株的病毒分離物Okra06基因組DNA-A全序列進行了分析，其具有菜豆金色花葉病毒屬單組分病毒基因組典型特征，且與已登陸GenBank中CLCuMV各分離物的相似性均大于89%，其中與分離物G6的相似性最高，達99.7%.根據(jù)目前雙生病毒科病毒分類標(biāo)準(zhǔn)［16］，分離物Okra06應(yīng)屬于菜豆金色花葉病毒屬的木爾坦棉花曲葉病毒種(CLCuMV).

該病毒分離物也伴隨有衛(wèi)星DNA β，其大小約為DNA-A的一半，除莖環(huán)結(jié)構(gòu)和TAATATTAC序列外，與病毒DNA-A無序列同源性.菜豆金色花葉病毒屬病毒伴隨的DNA β分子中含有一個115個核苷酸的保守區(qū)，推測是輔助病毒DNA-A編碼的復(fù)制蛋白識別作用位點［17］，Okra06 DNA β也不例外地含有該保守區(qū).Okra06 DNA β還含一個約230個核苷酸A-rich區(qū)，該區(qū)域可能與DNA β分子包裝過程中的尺寸要求有關(guān)［18］.該衛(wèi)星分子與侵染棉花的CLCuMV、CLCuV、CLCuBuV 病毒的 DNA β 分子相似性較高(大于82.6%)，其中與同是分離自廣東省廣州市的 CLCuMV－［G6］DNA β序列相似性最高(99.5%)，與來自中國廣西的 CLCuMV－［Gx08］DNA β相似性也高達99.3%;但與侵染黃秋葵或秋葵 的 BYVMV、OYVMV、OkLCuMV、OkLCV 和CLCuGV等5種病毒DNA β相似性僅有48.9% ～58.7%.這說明伴隨 CLCuMV侵染廣東黃秋葵的DNA β與世界上其他地區(qū)侵染黃秋葵的菜豆金色花葉病毒屬病毒衛(wèi)星分子是不同的.另外，對來自廣東、廣西不同地理區(qū)域的CLCuMV多個分離物研究還發(fā)現(xiàn)，其DNA-A及伴隨的DNA β分子序列相似性高達98% ～100%，變異很小(結(jié)果待發(fā)表)，說明發(fā)生在我國的 CLCuMV DNA β(即 Okra06 DAN β 和G6 DNA β)與其輔助病毒CLCuMV穩(wěn)定伴隨.

應(yīng)用菜豆金色花葉病毒屬病毒基因組B組分特異引物［10，19-20］進行 PCR，未能在 Okra06 中檢測到該組分的存在.目前，已報道的CLCuMV均僅有A組分，而且發(fā)現(xiàn)含衛(wèi)星 DNA β分子的雙生病毒CLCuMV、CLCuBV、CLCuGV、BYVMV 和 OYVMV 等也均為單組分病毒［16］.同時，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆接種試驗結(jié)果證明，Okra06 DNA-A和DNA β混合接種即可引起本生煙Nicotiana benthamiana產(chǎn)生曲葉癥狀(文中未顯示).因此，筆者認為:侵染廣東黃秋葵的CLCuMV分離物Okra06也是一個單組分菜豆金色花葉病毒屬病毒.

CLCuMV－［G6］是在我國發(fā)現(xiàn)的第一個CLCuMV分離物［8］，該分離物侵染錦葵科黃槿屬朱槿Hibiscus rosa-sinensis Linn.(又稱為扶桑、大紅花等)引起曲葉病［8］;隨后，將分離自我國朱槿的CLCuMV各分離物稱之為朱槿株系，該株系分離物可侵染朱槿、棉花引起曲葉?。?1-22］.本研究證明侵染黃秋葵的Okra06也是CLCuMV，而且該分離物與朱槿分離物G6相似性高達99.7%.因此，我們認為，侵染廣東黃秋葵引起黃脈曲葉病Okra06與先前報道的CLCuMV－［G6］［8］同屬木爾坦棉花曲葉病毒朱槿株系.

根據(jù)目前文獻，可侵染黃秋葵的菜豆金色花葉病毒屬病毒至少有11個種或暫定種，其中CLCuMV－［Ok］(AJ002459)與Okra06的相似性為93.9%，說 明 二 者 間 仍 存 在 一 定 差 異;OYVMV［9］、BYVMV［10］、BYVDV、BYVHV、BYVBV 與 Okra06 為害黃秋葵或秋葵的癥狀相似，但其相似性只有77.4% ～86.3%，表明Okra06與它們明顯不同;而OYCrV、OYMIV、OkLCV、OkMoV 和 CLCuGV 與Okra06的相似性為63.1% ～89.1%，說明這5種病毒與Okra06親緣關(guān)系也較遠.因此，引起廣東黃秋葵黃脈曲葉病的病毒分離物Okra06與世界其他地區(qū)報道可侵染黃秋葵的菜豆金色花葉病毒屬病毒是不同的.

棉花曲葉病毒是棉花上的毀滅性病害.該病害最先(1967年)發(fā)生在巴基斯坦木爾坦地區(qū)(Multan)，并于20世紀(jì)80年代末在巴基斯坦木爾坦地區(qū)開始流行，其后快速擴散到該國其他棉區(qū)及印度［20］.該病害是多種菜豆金色花葉病毒屬病毒侵染引起的，其中CLCuMV是引起巴基斯坦和印度棉花曲葉病大流行的主要病原病毒之一［21］.在我國，目前各棉區(qū)還未發(fā)生棉花曲葉病毒病，但現(xiàn)已在我國廣東和廣西表現(xiàn)為曲葉癥狀的朱槿和表現(xiàn)黃脈曲葉癥狀的黃秋葵病株上分別檢測鑒定到 CLCuMV［8，22］;更為重要的是，近期在廣西某個試驗田中發(fā)現(xiàn)了由CLCuMV自然侵染引起的棉花曲葉病植株［23］.雖然廣東、廣西等華南地區(qū)極少種植棉花，發(fā)生在廣東和廣西的CLCuMV不會立即傳播到我國棉花產(chǎn)區(qū)，但該病毒傳播介體煙粉虱在我國華南地區(qū)、長江流域和黃河流域等普遍發(fā)生，通過介體煙粉虱帶毒傳播到我國棉區(qū)是完全有可能的.因此，入侵廣東和廣西并已定殖的CLCuMV對我國棉花生產(chǎn)構(gòu)成了嚴重威脅［21］，應(yīng)引起我國有關(guān)部門的高度重視.

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