★ 劉丹彤 張小勇 馬小娜 王冬 趙偉鵬 孫良明 趙妍 王慶國(guó) (北京中醫(yī)藥大學(xué)2009級(jí)博士研究生 北京00029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué) 北京00029)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMs)是指具有生長(zhǎng)能力的子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮腔被覆黏膜以外的身體其他部位的一種疾病，以痛經(jīng)、性交不適、不孕等為主要臨床癥狀［1］。近年來，EMs發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)，且治療后復(fù)發(fā)率高，成為育齡期婦女的常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量。本事琥珀散出自宋·許叔微的《普濟(jì)本事方》，由三棱、莪術(shù)、赤芍、劉寄奴、丹皮、肉桂、熟地、當(dāng)歸、烏藥、元胡組成，具有行氣活血，溫經(jīng)止痛的功效，本為治療女子痛經(jīng)所設(shè)，現(xiàn)代亦常用來治療子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管阻塞性不孕等婦科疾病。在EMs的發(fā)病過程中，免疫失衡具有重要意義。Th1/Th2細(xì)胞的相互關(guān)系能夠反映機(jī)體的免疫狀態(tài)，因此Th1/Th2漂移與EMs密切相關(guān)。本研究擬探討本事琥珀散對(duì)EMs Th1/Th2細(xì)胞漂移的影響，為尋找本事琥珀散治療EMs的作用靶點(diǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)SD雌性成熟未孕大鼠，體重180g－200g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)SCXK(京):2008－0001，標(biāo)準(zhǔn)化環(huán)境(濕度:50% －70%，12h晝夜交替)飼養(yǎng)，每籠5只，予以滅菌飼料及飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

本事琥珀散組成及用量:三棱10g，莪術(shù)10g，赤芍 15g，劉寄奴 10g，丹皮 6g，肉桂 10g，熟地 10g，烏藥10g，元胡10g，當(dāng)歸15g。藥物劑量來自王慶國(guó)教授經(jīng)驗(yàn)用量。飲片均購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂門診部，由北京同仁堂藥店提供。藥物經(jīng)水浸泡半小時(shí)，煎煮40min后倒出藥液，再加水煎煮25min，將兩次煎得的藥液混合后加熱濃縮得到濃縮液。達(dá)那唑膠囊由江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號(hào):20110102)。將膠囊打開，藥粉兌入蒸餾水中，按比例配制成懸浮液。以上藥品配制完成后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，每周更換一次藥液。

水合氯醛，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào):20071129;注射用氨芐西林鈉，中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):09089024;己烯雌酚，合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號(hào):20080616;生理鹽水由中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):20090123。IFN-γ、IL-4試劑盒，德國(guó)BENDER公司。

2 方法

2.1 分組及給藥

50只SD大鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、偽手術(shù)組、疾病模型組、本事琥珀散組和達(dá)那唑組。正常組常規(guī)飼養(yǎng);偽手術(shù)組做大網(wǎng)移植;疾病模型組、本事琥珀散組和達(dá)那唑組均采用自體移植法復(fù)制子宮內(nèi)膜異位癥模型。，于術(shù)前第5天和術(shù)后第10天開始給予己烯雌酚灌胃0.02 mg/kg，連續(xù)5 d，使手術(shù)時(shí)大鼠統(tǒng)一處于動(dòng)情期;術(shù)后給予氨芐青霉素肌注16萬 u/kg，連續(xù)5 d。

造模1周后，各組開始灌胃給藥，連續(xù)4周。正常組和疾病模型組給予2ml生理鹽水灌胃，每日1次。其余各組藥量參照文獻(xiàn)換算，本事琥珀散組按成人公斤體重的8倍給藥(含生藥量為14g)，達(dá)那唑組按成人公斤體重的8倍給藥，16 mg/200g。

2.2 模型制作

(1)取雌性成熟未孕SD大鼠，于術(shù)前第5日和術(shù)后第10日開始給予己烯雌酚0.02mg/kg灌胃，每日一次，連續(xù)5日，使手術(shù)時(shí)大鼠統(tǒng)一處于動(dòng)情期。

(2)手術(shù)在室溫23℃ ～28℃環(huán)境下進(jìn)行，無菌操作。以10%水合氯醛(0.4ml/100g，腹腔注射)麻醉大鼠。

(3)待麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)板上，腹部備皮，常規(guī)消毒鋪巾。選取尿道口上端約1cm處為切入點(diǎn)，沿腹中線切開1.5～2 cm的縱形切口，逐層分離腹壁進(jìn)入盆腔。探查大鼠子宮(呈V型)，細(xì)絲線結(jié)扎左側(cè)局部子宮血管以及需切除的子宮上下端。

(4)取大鼠左側(cè)子宮角長(zhǎng)約1～2 cm，立即放入PBS溶液中，修剪去除子宮漿膜外的脂肪組織，縱向切開子宮腔，切取5×5 mm大小的子宮片段，使其內(nèi)膜面與右側(cè)腹膜相對(duì)，用5－0號(hào)絲線將其四角縫于右側(cè)腹壁，縫合處盡量遠(yuǎn)離手術(shù)切口，以減少組織粘連，并防止取材再次開腹時(shí)損傷已種植的異位組織。剩余部分子宮片進(jìn)行組織學(xué)觀察，以證實(shí)移植物確為子宮內(nèi)膜組織。

(5)關(guān)腹前向腹腔滴入以0.9%生理鹽水溶解的氨芐青霉素16萬u/kg進(jìn)行腹腔消毒，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后第1日開始給予氨芐青霉素16萬u/kg肌肉注射，每日一次，連續(xù)5日。

(6)術(shù)后大鼠分籠單放，自然蘇醒，常規(guī)飼養(yǎng)。

建模4周后隨機(jī)選取2只模型大鼠開腹檢查移植物生長(zhǎng)情況，并送病檢，驗(yàn)證造模效果(結(jié)果如下圖)。

由上圖可見，疾病模型大鼠手術(shù)4周后移植物體積明顯增大，呈圓形，內(nèi)有半透明囊液，表面有結(jié)締組織覆蓋和血管形成，質(zhì)軟。病理檢查可見正常大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列整齊，呈長(zhǎng)柱狀，肌層較厚，結(jié)構(gòu)完整，腺體和血管豐富;疾病模型大鼠移植物囊內(nèi)壁有內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)，上皮細(xì)胞呈低柱狀，較扁平，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，肌層較薄，腺體較少。根據(jù)大體觀察以及病理檢查結(jié)果，可以認(rèn)為EMs模型復(fù)制成功。

2.3 成模標(biāo)準(zhǔn)

取材時(shí)開腹觀察移植物，可見移植物體積增大，呈圓形或橢圓形囊泡，內(nèi)有透明或半透明囊液，部分為粘稠不透明液體，表面有血管形成。用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植物體積，根據(jù)Katsuki方法:體積(V)=長(zhǎng)×寬×高，移植物體積≥8mm3者，即為模型復(fù)制成功［2、3］。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

于造模后第5周，用10%的水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉動(dòng)物，開腹(開腹時(shí)盡量避開造模時(shí)子宮內(nèi)膜種植部位)后，腹主動(dòng)脈采血，用ELISA法檢測(cè)血清IFN-γ、IL-4水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

與正常組比較，疾病模型組大鼠血清IFN-γ和IL-4含量分別呈升高和降低趨勢(shì);與疾病模型組比較，本事琥珀散組IFN-γ和IL-4均有所降低和升高。疾病模型組IFN-γ/IL-4較正常組明顯升高，較本事琥珀散組明顯降低，組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。見下表。

本事琥珀散對(duì)EMs大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影響，注:與疾病模型組相比★P ＜0.05。

4 討論

作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的功能組成部分，T細(xì)胞在人體的免疫系統(tǒng)中占有重要地位，其中的輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)與EMs存在著密切聯(lián)系。經(jīng)抗原刺激的前體細(xì)胞(Thp)分化而來的Th0經(jīng)細(xì)胞因子等多種因素影響向Th1或Th2分化發(fā)育。Th1、Th2細(xì)胞既在增殖分化的過程中受到細(xì)胞因子的影響，分化后又通過分泌多種細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)并抑制Th0向另一類型Th細(xì)胞分化。Th1、Th2細(xì)胞和這些細(xì)胞因子之間相互作用，相互制約，調(diào)節(jié)著機(jī)體的免疫平衡狀態(tài)，維持正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能［4］。在某種狀態(tài)下，Th1/Th2的動(dòng)態(tài)平衡被打破，出現(xiàn)偏向Th1或Th2的優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，就稱為Th1/Th2漂移［5］，會(huì)引起疾病的發(fā)生。目前已經(jīng)證實(shí)，許多腫瘤和自身免疫性疾病患者體內(nèi)均存在Thl/Th2漂移現(xiàn)象，且與腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。

Th1細(xì)胞主要是在抗原激活了靜息的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)后協(xié)助其發(fā)育成為效應(yīng)性T細(xì)胞，通過分泌細(xì)胞因子、激活巨噬細(xì)胞而介導(dǎo)細(xì)胞免疫效應(yīng)和遲發(fā)性超敏反應(yīng)。IFN-γ和IL-12通過信號(hào)傳導(dǎo)使T細(xì)胞增值分化為Th1細(xì)胞，分化后的Th1細(xì)胞主要產(chǎn)生 IFN-γ、IL-2［6］。Th2細(xì)胞則主要輔助 B細(xì)胞增殖分化成漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)體液免疫效應(yīng)。IL-4是促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞的重要因子，而Th2細(xì)胞又會(huì)產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子。一般認(rèn)為，在同種器官的移植中，Th1參與了急性移植物的排斥，而Th2則更易于誘導(dǎo)移植耐受［7］。IFN-γ 和 IL-4 作為 Th1、Th2 細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子其含量及比值的變化被認(rèn)為能夠間接反映 Th1/Th2 的平衡狀態(tài)［8］。

Hsu等［9］在1997年發(fā)現(xiàn)EMT患者外周血單核細(xì)胞和腹腔液中Th1細(xì)胞群功能下降，并認(rèn)為這可能對(duì)EMT的發(fā)生具有始動(dòng)作用。此后，許多研究均發(fā)現(xiàn)［10］、［11］EMs患者血清和腹腔液中存在 IFN-γ、IL-2水平低于正常婦女，而IL-4、IL-10水平升高的現(xiàn)象。但亦有研究表明在EMs或合并不孕患者的腹腔液中 IL-2 有所增高［12］、［13］，并認(rèn)為正是因?yàn)镮L-2的增多，誘導(dǎo)、促進(jìn)了多種細(xì)胞毒細(xì)胞的活性，增強(qiáng)了機(jī)體免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致了炎癥、疼痛和不孕的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:疾病模型組較正常組具有IFN-γ升高和IL-4降低的趨勢(shì)，尤其是IFN-γ/IL-4明顯升高。IFN-γ能夠激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)，并激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，刺激ICAM-1表達(dá)，客觀上為移植物的種植生長(zhǎng)提供了條件。IL-4能夠促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化、抑制Th1細(xì)胞增殖及應(yīng)答。血清IFN-γ的升高和IL-4的降低提示機(jī)體免疫有由Th2向Th1漂移的傾向。考慮本實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)被認(rèn)為是EMs發(fā)生始動(dòng)因素的Th1向Th2漂移現(xiàn)象，可能是EMs患者和動(dòng)物模型的差別造成的。EMs患者的異位內(nèi)膜是主動(dòng)異位，即首先是患者自身存在細(xì)胞免疫狀態(tài)的低下，繼而引起隨逆流經(jīng)血進(jìn)入腹腔的子宮內(nèi)膜成功逃脫免疫監(jiān)視而種植下來;而EMs模型大鼠的異位內(nèi)膜則是被動(dòng)異位，即子宮內(nèi)膜經(jīng)人為剝離種植在腹腔，種植之前大鼠本身并沒有機(jī)體免疫低下的情況存在。

本事琥珀散及達(dá)那唑均對(duì)EMs模型大鼠外周血Th2向Th1漂移的情況有糾正作用。雖然在IFN-γ和IL-4血清含量方面，本事琥珀散組和疾病模型組比較沒有顯著性差異，但I(xiàn)FN-γ/IL-4比值卻存在明顯變化。IFN-γ所代表的Th1細(xì)胞和IL-4所代表的Th2細(xì)胞之間存在一種相互抑制的關(guān)系。疾病模型組相較于正常組IFN-γ/IL-4比值的升高，提示Th1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。此時(shí)，Th1細(xì)胞會(huì)憑借自身自分泌和旁分泌的功能，以及其所分泌細(xì)胞因子對(duì)Th2細(xì)胞的抑制作用，并且隨著病情的發(fā)展，Th1細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)被逐漸放大。而本事琥珀散組IFN-γ/IL-4比疾病模型組明顯降低，說明在本事琥珀散的作用下，Th1細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)被抑制，從而起到了對(duì) EMs Th1/Th2漂移的調(diào)節(jié)作用。

本事琥珀散對(duì)細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用可能與其行氣活血的功效有關(guān)。有研究［14］發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散能夠調(diào)節(jié)肝郁證大鼠Th2向Th1漂移的現(xiàn)象。柴胡疏肝散是疏肝行氣活血的代表方之一，因而可以推斷行氣活血功效在調(diào)節(jié)Th/Th2漂移方面有所作為，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。至于本事琥珀散是否對(duì)Th1/Th2的漂移具有雙向調(diào)節(jié)作用，即是否會(huì)對(duì)造成EMs發(fā)生的細(xì)胞免疫低下狀態(tài)有改善作用，還需進(jìn)一步的臨床觀察。

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