楊春菊 許建新

(曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，云南 曲靖 655000)

甲醛對(duì)秀麗隱桿線蟲毒性效應(yīng)的研究*

楊春菊 許建新

(曲靖醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，云南 曲靖 655000)

為闡明甲醛染毒的毒性效應(yīng)，利用模式生物秀麗隱桿線蟲進(jìn)行運(yùn)動(dòng)能力和壽命等生物學(xué)指標(biāo)的研究。結(jié)果顯示，甲醛染毒組與對(duì)照組相比，其頭部擺動(dòng)頻率、身體彎曲頻率、壽命和半致死時(shí)間均有所下降，且與甲醛染毒濃度存在量效關(guān)系。本文為理解與闡明甲醛的毒性效應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)資料，有助于深入開展甲醛毒性機(jī)理的研究。

秀麗隱桿線蟲;甲醛;毒性

近年來隨著經(jīng)濟(jì)水平的發(fā)展，甲醛從衣食住行等各方面進(jìn)入我們的生活，其污染問題越來越引起人們的注意。在我國(guó)有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單上甲醛高居第二位，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu) (International Agency for Research on Cancer，IARC)把甲醛列為第一類致癌物質(zhì)。甲醛 (Formaldehyde，F(xiàn)A)，俗名蟻醛，是一種無(wú)色有刺激氣味的氣體，它對(duì)粘膜具有刺激性，可降低機(jī)體的呼吸功能、神經(jīng)系統(tǒng)信息整合功能和影響機(jī)體的免疫應(yīng)答，對(duì)心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、腎臟均具有毒性作用［1，2］。甲醛的致癌性，尤其是對(duì)鼻腔、鼻咽、肺的致癌作用已被公認(rèn)。

秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)作為一種模式生物，具有容易培養(yǎng)、繁殖周期短、個(gè)體小、通體透明、遺傳與發(fā)育背景清楚等諸多優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各領(lǐng)域的研究。由于秀麗隱桿線蟲對(duì)多種污染物敏感，且行為反應(yīng)模式穩(wěn)定、結(jié)果可靠，已被用來監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)污染［3］。而關(guān)于甲醛對(duì)秀麗隱桿線蟲的生態(tài)毒性的研究，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。因此本文以秀麗隱桿線蟲為指示動(dòng)物，觀察甲醛對(duì)其運(yùn)動(dòng)、壽命相關(guān)指標(biāo)的影響，探討甲醛暴露的毒性效應(yīng)，以期為甲醛的環(huán)境污染監(jiān)測(cè)和治理提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:秀麗隱桿線蟲 (C.elegans)，由云南省生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

主要試劑:10%的甲醛溶液 (AR級(jí)，SIGMA公司)。

1.2 甲醛染毒

將秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)在含有大腸桿菌OP50的瓊脂培養(yǎng)基 (NGM)上。實(shí)驗(yàn)設(shè)1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)甲醛染毒組，培養(yǎng)基所含甲醛濃度分別為5μmol/L、20μmol/L、80μmol/L，染毒時(shí)間為1h。所有秀麗隱桿線蟲均在20℃條件下培養(yǎng)。

1.3 頭部擺動(dòng)頻率的測(cè)定

甲醛染毒后，在一個(gè)新的培養(yǎng)基上滴加50μL的M9緩沖溶液，將線蟲挑入緩沖溶液中。經(jīng)過1min的恢復(fù)后，記錄線蟲在1min時(shí)間內(nèi)頭部擺動(dòng)的次數(shù) (當(dāng)身體彎曲達(dá)到體長(zhǎng)的一半作為1次頭部擺動(dòng))。各組均隨機(jī)選取并測(cè)定50條線蟲。具體參照Tsalik［4］的方法。

1.4 身體彎曲頻度的測(cè)定

甲醛染毒后，將線蟲挑到一個(gè)沒有OP50的NGM培養(yǎng)基上。記錄下20s內(nèi)線蟲身體彎曲的次數(shù)。假定沿咽泵的方向?yàn)閥軸，線蟲爬行過程中，身體沿著相應(yīng)x軸方向上的1次改變定義為1個(gè)身體彎曲。各組均隨機(jī)選取并測(cè)定50條線蟲。具體參照Tsalik［4］的方法。

1.5 壽命與半致死天數(shù)的測(cè)定

甲醛染毒后，將線蟲置于正常的NGM培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每間隔1d記錄存活線蟲數(shù)目(排除受試線蟲與其新產(chǎn)生的子代幼蟲可能的混雜)。當(dāng)線蟲的存活數(shù)目減少為總數(shù)的二分之一時(shí)，記錄下測(cè)試天數(shù)，即為半致死天數(shù)。當(dāng)最后一條線蟲死亡時(shí)，所記錄的時(shí)間即為最長(zhǎng)壽命。進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用分析軟件SPSS13.0進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，用S－N－K和LSD法進(jìn)行兩兩顯著性檢驗(yàn)。

2.結(jié)果與分析

2.1 甲醛染毒對(duì)秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)能力的影響

為考察甲醛染毒對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響，分析線蟲頭部擺動(dòng)頻率。方差分析結(jié)果表明，甲醛染毒后，秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)能力受到顯著影響 (F=142.17，P=0.000＜0.01);進(jìn)一步對(duì)各甲醛染毒組與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果提示，各濃度甲醛染毒組均對(duì)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)能力造成嚴(yán)重影響 (P=0.000＜0.01)(詳見圖1)。

2.2 甲醛染毒對(duì)秀麗隱桿線蟲身體彎曲能力的影響

為考察甲醛染毒對(duì)秀麗隱桿線蟲運(yùn)動(dòng)能力的影響，分析線蟲身體彎曲頻率。結(jié)果表明，甲醛染毒后，秀麗隱桿線蟲的身體擺動(dòng)能力受到顯著影響 (F=129.51，P=0.000＜0.01)。進(jìn)一步對(duì)各甲醛染毒組與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明，各濃度甲醛染毒組均對(duì)秀麗隱桿線蟲的身體彎曲能力造成嚴(yán)重影響 (P=0.000＜0.01)(詳見圖2)。

2.3 甲醛染毒對(duì)秀麗隱桿線蟲壽命的影響

存活率與半致死天數(shù)是衡量化合物毒性的主要參數(shù)之一。在5μmol/L、20μmol/L、80μmol/L三種甲醛濃度處理后，與對(duì)照組相比，線蟲壽命分別減少了2天、2天和4天(詳見圖3)。為排除個(gè)體差異所造成的存活率誤差，本研究采用半致死天數(shù)來衡量甲醛暴露對(duì)線蟲壽命的影響。對(duì)半致死天數(shù)進(jìn)行方差分析，并對(duì)各甲醛染毒組與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明，甲醛染毒后，秀麗隱桿線蟲壽命縮減，尤其在高濃度 (20μmol/L和80μmol/L)甲醛染毒后，線蟲死亡加劇 (F=24.41，P=0.000＜0.01)(見圖4)。

3.討論

本研究對(duì)照組和甲醛染毒組頭部擺動(dòng)頻率和身體彎曲頻率參數(shù)指標(biāo)有明顯差異，表明甲醛染毒對(duì)線蟲神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，已有研究證明污染物暴露會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元與肌肉細(xì)胞之間的連接破壞，從而引起運(yùn)動(dòng)行為障礙［5］。甲醛染毒后，秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)突觸功能和神經(jīng)肌肉接頭連接可能遭到破壞，從而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)行為缺陷，運(yùn)動(dòng)能力下降。

污染物會(huì)導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲壽命縮短，且隨濃度增加壽命縮短的速度加快［6］。本文研究發(fā)現(xiàn)，甲醛染毒組的最長(zhǎng)壽命和半數(shù)致死時(shí)間都低于對(duì)照組，說明甲醛對(duì)秀麗隱桿線蟲有明顯的致死效應(yīng)。

甲醛系醛類化合物，其羧基親電性較強(qiáng)，而且甲醛本身結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，空間位阻較小，容易和生物大分子發(fā)生加合、交聯(lián)等作用。甲醛進(jìn)入機(jī)體內(nèi)易結(jié)合生物大分子上的自由氨基生成不穩(wěn)定的羥甲基加合物，直接引起堿基突變或造成DNA斷裂、DNA－DNA交聯(lián)、DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián) (DNA－Protein Crosslinks，DPC)等作用［7］。甘耀坤等對(duì)甲醛致中華卵索線蟲DNA損傷進(jìn)行研究，結(jié)果表明甲醛在低濃度 (125μmol/L)時(shí)不能顯著誘導(dǎo)DPC的形成。而在較高濃度 (625μmol/L)時(shí)顯著誘導(dǎo)DPC的形成;甲醛在低濃度 (5μmol/L、25μmol/L)時(shí)主要產(chǎn)生DNA斷裂，而高濃度 (125μmol/L、625μmol/L)時(shí)主要產(chǎn)生DNA交聯(lián)，且甲醛濃度與DNA損傷具有明顯的量效關(guān)系［8］。該研究從DNA損傷角度為本次實(shí)驗(yàn)提供理論支持，低濃度甲醛暴露下致使DNA斷裂，進(jìn)而降低線蟲運(yùn)動(dòng)能力和壽命，并且隨濃度的增加影響越發(fā)嚴(yán)重。

本研究利用模式生物秀麗隱桿線蟲發(fā)育上與實(shí)驗(yàn)室操作上的優(yōu)勢(shì)，以其為模型分析了甲醛染毒對(duì)線蟲運(yùn)動(dòng)能力和壽命的毒性效應(yīng)，為闡明甲醛的毒性效應(yīng)提供了新的線索，有助于理解和深入追蹤甲醛染毒導(dǎo)致的各種毒性機(jī)理。研究顯示，甲醛染毒對(duì)秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)能力和壽命具有顯著毒效，且與甲醛濃度存在一定的量效關(guān)系;模式生物秀麗隱桿線蟲可以作為一種的甲醛暴露的生物指示物。值得注意的是，甲醛對(duì)秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)的機(jī)制是怎樣的，這種毒性效應(yīng)是否有具有可傳遞性，需要進(jìn)一步研究。

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Research on Toxic Effects of Formaldehyde to Caenorhabditis elegans

YANG Chun－ju;XU Jian－xin
(Qujing Medical College，Qujing 655000，China)

To explain the effects of formaldehyde toxicity，this study explored the model organism Caenorhabditis elegans to analyze the toxicities by assaying endpoints of life span and locomotivity．Results show that formaldehyde＇s toxicity may result in the reduced lifespan and locomotion behavior defects．In addition，the biological defects caused by formaldehyde exposure have had a concentration－dependent manner．This research provided the experimental data to understand and clarify the toxic effects of formaldehyde．

Caenorhabditis elegans;formaldehyde;toxicity

Q959.17

A

1671－7406(2012)06－0041－04

2012－03－25

楊春菊 (1981—)，女，云南曲靖人，碩士，助教，主要從事生物化學(xué)和免疫學(xué)的教學(xué)與研究。

(責(zé)任編輯 徐成東)