陳開祥,周新華,秦愛建

(1.江蘇省連云港市第二人民醫(yī)院急診中心,江蘇連云港,222000;2.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇揚(yáng)州,225003)

心力衰竭是各種心臟疾病的終末階段,研究心力衰竭的發(fā)生機(jī)制對(duì)該病的防治極其重要。心肌舒縮功能與肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的活性密切相關(guān),SERCA2a活性主要由受磷蛋白(PLB)調(diào)控,PLB是心臟心肌收縮和β-腎上腺素能激活的基本調(diào)節(jié)蛋白[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立異丙腎上腺素誘導(dǎo)心力衰竭大鼠模型,觀察心力衰竭大鼠肌漿網(wǎng)PLB基因和蛋白表達(dá)與磷酸化的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6周齡S-D大鼠80只,雌雄不拘,體質(zhì)量140～160 g,購(gòu)置揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比較中心。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑與器材

H-89(美國(guó)CALBIOCHEM 公司);異丙腎上腺素(美國(guó)Sigma公司);[γ-32P]ATP(北京福瑞生物工程公司);Phospholamban小鼠抗大鼠單克隆抗體(美國(guó)ABR公司);HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(美國(guó)Sigma公司);HRP標(biāo)記的抗大鼠GAPDH抗體(上?？党缮锛夹g(shù)有限公司);ECL檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司);Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)(南京美易生物技術(shù)有限公司)。

1.3 心衰模型的制備[2]

造模組40只大鼠給予異丙腎上腺素2 mg/(kg·d)皮下注射,共4周,實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡4只,存活36只。對(duì)照組(40只)給予0.9%生理鹽水0.5 mL皮下注射。制模期間嚴(yán)格掌握給藥量和給藥時(shí)間,注意觀察動(dòng)物活動(dòng)、全身狀態(tài)和攝食情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥

造模4周后用導(dǎo)管法檢測(cè)大鼠血流動(dòng)力學(xué)。予直徑約0.5 mm的硬塑管至左心室,連接八導(dǎo)電生理記錄儀觀察記錄心率、左心室壓力曲線,包括左心室舒張末壓(LVEDP)和左心室收縮壓(LVSP),推算左心室壓力最大上升速率(+dp/dtmax)和左心室壓力最大下降速率(-dp/dtmax)。將造模成功的36只心衰大鼠和40只正常大鼠分別隨機(jī)分H-89陰性亞組和陽(yáng)性亞組。各組大鼠在相同條件下飼養(yǎng),分組后大鼠分別進(jìn)行如下處理:①H-89陽(yáng)性亞組:按0.05 mg/(kg·d)予 H-89(3 μ mol/L)灌胃[3],1 d/次;②H-89陰性亞組:予等體積的二甲亞砜(DMSO)灌胃,1 d/次,共給藥8周。

1.5 血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定和左心室重量指數(shù)(LVMI)測(cè)定

給藥8周后如上方法再檢測(cè) LVSP及LVEDP,估算+dp/dtmax和-dp/dtmax。大鼠麻醉后稱重,斷頭猝死立即取出心臟,剪取左心室和室間隔組織,濾紙吸干水分,稱重,計(jì)算左室(含室間隔)與體質(zhì)量比值,以mg/g表示。

1.6 PLBmRNA表達(dá)的檢測(cè)

PLB:Forward:5′-AAGTCCAATACCT TAC TCGCTCGG-3′;Reverse:5′-TCACAGTAGCATCACAATGATGCAG-3′;β-actin:Forward:5′-AGCCATGTACGTAGCCATCCAG-3′;Reverse:5′-CGGTCAGGATCT TCATGAGGTAGT-3′,用Trizol法提取心肌組織總RNA。用AMV二步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄條件:42℃反轉(zhuǎn)錄1 h;PCR條件:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30s,72℃延伸30s,行28個(gè)循環(huán)擴(kuò)增,再以72℃延伸8 min。電泳、凝膠成像,軟件分析。并以PLB擴(kuò)增帶的平均灰度值分別與βaction擴(kuò)增帶的平均灰度值的比值表示PLB基因的表達(dá)量。

1.7 PLB蛋白表達(dá)的檢測(cè)

先制備心肌肌漿網(wǎng)勻漿。將大鼠處死后取心室組織,充分研磨。將勻漿離心,收集上清再離心,上清再離心(20 kg,60 min,4℃),最后將獲得的沉淀物(即肌漿網(wǎng)粗提物)用重懸液[成分(mmol/L):組氨酸 30、蔗糖 0.25、EDTA 10 和NaF 10,pH7.4]重懸。用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

再各取20 μg變性總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠(15%)電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉抗原,與小鼠抗大鼠的單克隆PLB抗體(購(gòu)自美國(guó)ABR公司,1:500稀釋)雜交,洗膜并與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠的抗體(購(gòu)至美國(guó)SIGMA公司,1∶5000稀釋)和HRP標(biāo)記的抗大鼠的GAPDH抗體(購(gòu)至上?？党缮锛夹g(shù)有限公司,1∶5000稀釋)共同孵育。顯色,曝光、顯影、定影,軟件分析。并以PLB的平均灰度值與相應(yīng)PAGDH的平均灰度值的比值表示PLB蛋白的表達(dá)量。

1.8 PLB磷酸化水平的檢測(cè)

各取30 μg總蛋白置入 30 μL的反應(yīng)液中,并迅速加入釩酸鈉、焦磷酸鈉、5.6 μL PKA 催化亞單位(H-89干預(yù)組同時(shí)再加入50 μ mol/L的H-8910 μL),37 ℃預(yù)孵育 5 min。加入 30 μ Ci[r-32P]ATP啟動(dòng)磷酸化反應(yīng),37℃5 min,加入SDS上樣緩沖液終止磷酸化反應(yīng),再進(jìn)行SDSPAGE凝膠(12%)電泳,染色、脫色、烘膠,曝光、顯影、定影。軟件分析計(jì)算條帶的平均灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 對(duì)照組與造模組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和左室指數(shù)的檢測(cè)和計(jì)算

與對(duì)照組比較,造模組的心肌收縮功能明顯下降(P<0.05),左室指數(shù)顯著增大(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 對(duì)照組與造模組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

表1 對(duì)照組與造模組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

＊P<0.05。

分組 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVM I(mg/g)對(duì)照組 20 66.21±4.3 1.09±0.11 2608.4±40.8 -2620.8±35.8 0.353±0.03造模組 60 49.46±2.2＊ 2.83±0.36＊ 1806.6±38.4＊ -1789.3±39.0＊ 0.438±0.02＊

2.2 各實(shí)驗(yàn)組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和左室指數(shù)的檢測(cè)和計(jì)算

前胡丙素組較心力衰竭組左室收縮功能明顯改善(P<0.05),心臟左室指數(shù)明顯降低(P<0.05);同時(shí)H-89亞組與相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組比較,左室收縮功能增強(qiáng)(P<0.05),左室指數(shù)亦降低(P<0.05,唯有正常組2亞組 P>0.05)。如下表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

表2 各實(shí)驗(yàn)組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)和左室指數(shù)的比較()

與相應(yīng)的對(duì)照組比較,△P<0.05,+H-89亞組與相應(yīng)的組比較,＊P<0.05。

分組 n LVSP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVM I(mg/g)對(duì)照組 10 69.31±4.9 1.17±0.14 2537.1±48.7 -2672.7±38.2 0.372±0.03+H-89亞組 10 57.52±4.7＊ 1.02±0.17＊ 2128.6±41.2＊ -2122.7±40.3＊ 0.387±0.04心衰組 12 49.65±2.2■ 3.03±0.38■ 1863.3±40.9■ -1895.2±37.4■ 0.440±0.05＊+H-89亞組 12 40.37±4.2＊ 2.21±0.31＊ 1724.1±34.5＊ 1735.0±35.7＊ 0.490±0.05＊

2.3 各組PLBmRNA表達(dá)量結(jié)果

與對(duì)照組比較,心力衰竭組PLBmRNA表達(dá)量明顯升高(P<0.01),同時(shí)各H-89亞組較相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組比較,PLBmRNA表達(dá)量均顯著下降(P<0.01),見圖1。

圖1 各組PLBmRNA表達(dá)水平的比較

2.4 各組PLB蛋白表達(dá)量結(jié)果

與對(duì)照組比較,心力衰竭組蛋白表達(dá)量明顯升高(P<0.01),同時(shí)各H-89亞組較相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組比較,PLB蛋白表達(dá)量均顯著下降(P<0.01),見圖2。

圖2 各組PLB蛋白表達(dá)水平的比較

2.5 各組PLB蛋白磷酸化水平檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組比較,心力衰竭組PLB蛋白磷酸化水平明顯下降(P<0.01),同時(shí)各H-89亞組較相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組比較,PLB蛋白磷酸化水平均顯著下降(P<0.01),見圖3。

圖3 各組PLB磷酸化水平的比較

3 討 論

心力衰竭是各種心臟病的終末期表現(xiàn),眾多研究已知心力衰竭與許多神經(jīng)體液因子異常有關(guān),但其具體發(fā)生的分子機(jī)制較復(fù)雜,目前并非十分明確,可能涉及各種離子通道、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及能量產(chǎn)生等方面,其中心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)失衡尤為重要。肌漿網(wǎng)將Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)而引起心肌細(xì)胞收縮;再通過(guò)SERCA2a將Ca2+泵回到肌漿網(wǎng)而實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞舒張。迄今為止PLB被認(rèn)為是肌漿網(wǎng)中調(diào)控SERCA2a的活性的唯一磷酸化底物。有研究顯示SERCA2a活性減弱與心力衰竭的發(fā)生密切相關(guān)[4]。

作者在以往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧后PLB磷酸化水平顯著下降,同時(shí)基因和蛋白表達(dá)水平亦明顯下降[5]。本課題發(fā)現(xiàn)心力衰竭大鼠左室明顯肥厚,而且收縮功能減弱,受磷蛋白基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平明顯升高,可能與PLB在心力衰竭發(fā)展過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間抑制SERCA2a的活性,心肌肌漿網(wǎng)調(diào)控Ca2+異常,致心肌收縮功能受損。同時(shí)心力衰竭大鼠PLB磷酸化水平下降,亦致使肌漿網(wǎng)SERCA2a轉(zhuǎn)運(yùn)鈣離子能力下降,終出現(xiàn)心肌收縮功能不全。有學(xué)者[6]用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)證實(shí)未磷酸化的PLB能抑制SERCA2a的功能,減弱心肌收縮和舒張功能,在心力衰竭的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。在超表達(dá)PLB的轉(zhuǎn)基因大鼠中,發(fā)現(xiàn)SERCA2a攝取Ca2+功能受抑制,心肌收縮功能受損,心室重塑、間質(zhì)纖維化、胎兒基因轉(zhuǎn)錄和心肌肥厚,最終導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病、心力衰竭[7]。在PLB缺陷小鼠中SERCA2a對(duì)Ca2+親和力增強(qiáng),心肌舒縮功能增強(qiáng),而心率未發(fā)生變化,這進(jìn)一步說(shuō)明PLB在調(diào)節(jié)心臟功能方面起著重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)同上述亦證實(shí)了PLB在心力衰竭的發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要,可能通過(guò)調(diào)控肌漿網(wǎng)SERCA2a的活性終導(dǎo)致心肌舒縮功能障礙。

PLB的磷酸化則由不同的激酶和磷酸酯酶所調(diào)控。迄今為止已知PLB有3個(gè)磷酸化位點(diǎn),分別為絲氨酸-16(Ser16),蘇氨酸-17(Thr17)和蘇氨酸-10(Thr10),其中Ser16可被cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)磷酸化。在β-腎上腺素能激動(dòng)過(guò)程中,Ser16是主要磷酸化位點(diǎn),并能調(diào)控完整的β-腎上腺素能效應(yīng);Thr17的磷酸化可能僅發(fā)生在胞質(zhì)Ca2+濃度充分升高之后,即β-腎上腺素能激動(dòng)達(dá)到最高水平時(shí)。cAMPPKA通路是心肌細(xì)胞發(fā)揮生理性能重要的神經(jīng)激素信號(hào)傳導(dǎo)通路。心肌β1-腎上腺素受體(β1-AR)激活,觸發(fā)cAMP依賴的激酶活化,使心肌細(xì)胞PKA活性持久增強(qiáng),促使PLB磷酸化,促進(jìn)SERCA2a對(duì) Ca2+的攝取,進(jìn)而增加了肌漿網(wǎng)Ca2+濃度和促進(jìn)肌肉收縮時(shí)Ca2+的釋放終致心肌細(xì)胞收縮[9]。臨床研究發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者PLB Ser16和Thr17位點(diǎn)的磷酸化均下降,PLB的抑制作用明顯增強(qiáng)[10]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠分別給予PKA特異性抑制劑(H-89),觀察各組PLB的表達(dá)水平和磷酸化水平以及心臟血流動(dòng)力學(xué)改變。我們發(fā)現(xiàn)各H-89亞組較相應(yīng)對(duì)照組PLBmRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降,同時(shí)PLB磷酸化水平亦降低;而且各H-89亞組的心臟收縮功能較對(duì)照組均下降。我們推測(cè)H-89可能通過(guò)cAMP-PKA通路抑制心肌肌漿網(wǎng)PLB磷酸化,使SERCA2a對(duì)Ca2+的攝取能力下降,導(dǎo)致心肌收縮功能減退,造成心力衰竭。

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