鄧建忠,金建華,陸文斌,王 芳,李獻(xiàn)文

(江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,江蘇常州,213002)

胃癌是中國(guó)最常見的胃腸道腫瘤之一,因其早期癥狀不明顯,大多數(shù)患者被確診時(shí)病程已至進(jìn)展期。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制基因,選擇性地在腫瘤中表達(dá)。作者前期研究發(fā)現(xiàn),其也表達(dá)于胃癌患者的外周血中,而且具有抑制細(xì)胞凋亡,調(diào)控細(xì)胞周期及參與血管形成的作用[1]。因此,檢測(cè)外周血中Survivin的表達(dá),有可能成為檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移及判斷預(yù)后的參考指標(biāo)之一。本研究旨在探討外周血survivin mRNA的表達(dá)水平與胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用及預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇2007年10月～2009年8月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)人民醫(yī)院腫瘤科、消化內(nèi)科和外科就診并經(jīng)胃鏡活檢組織及術(shù)后病理確診為胃癌患者55例(轉(zhuǎn)移28例,未轉(zhuǎn)移 27例),男 30例(轉(zhuǎn)移19例,未轉(zhuǎn)移 11例),女 25例(轉(zhuǎn)移 17例,未轉(zhuǎn)移8例)。年齡 32～72歲,中位年齡 58歲。TNM 分期:Ⅰ期3例,Ⅱ期9例,Ⅲ期15例,Ⅳ期28例。采用2002年第6版AJCC胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血總RNA的提取、完整性和純度檢測(cè):根據(jù)試劑盒操作說明,應(yīng)用Trizol Reagant按照說明書進(jìn)行提取RNA,所提取的總RNA用紫外分光光度計(jì)定量并檢測(cè)其純度。A260/A280≥1.8為合格。所提取的總RNA完整性經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定。-70℃保存待用。

1.2.2 cDNA 合成:20 μL反應(yīng)體系中含:總RNA 1 μg,10 ×緩沖液 2 μL,dNTPs(10 mmol/L)2 μL,100 ng 隨機(jī)引物 ,M-MLV(10 U/μL)2 μL,加DEPC水至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為:37℃60 min,95℃5 min,70℃保存待用。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR):利用DNAman軟件設(shè)計(jì)RT-PCR Survivin和管家基因GAPDH的引物:GAPDH上游引物為 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′,下游引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′, 探針序列為 5′-CAAGCT TCCCGTTCTCAGCC-3′;Survivin上游引物為5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′, 下游引物為 5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′,探針序列為 5′-CCTGGCAGCCCTTTCTCAAGGACC-3′。 用 RTPCR法檢測(cè)患者外周血中Survivin mRNA的表達(dá)水平,GAPDH為內(nèi)參照,PCR試劑盒、引物及探針合成中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因有限公司提供。50?L RT-PCR反應(yīng)體系中含:1×定量緩沖液 ,200 μ mol/L dNTPs,5 UampliTaq Gold,Survivin上下游引物各600 nmol/L,熒光探針200 nmol/L,100 ng cDNA,反應(yīng)條件為:50℃10s,95℃10 min,然后95℃30s,60℃1 min,共40個(gè)循環(huán),PCR反應(yīng)結(jié)束后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自動(dòng)進(jìn)行分析,對(duì)每一份標(biāo)本均設(shè)副孔,采用GAPDH為內(nèi)參基因,以Survivin/GAPDH的比值計(jì)算出待測(cè)樣品的拷貝數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:共有55例患者入組,到隨訪終止時(shí)仍有3例患者(Ⅰ期2例,Ⅱ期1例)未出現(xiàn)疾病進(jìn)展。生存分析采用Kaplan-Meier方法。計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn),用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型評(píng)估影響預(yù)后生存的各變量。采用雙側(cè)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。所有資料均應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié) 果

2.1 Survivin mRNA檢測(cè)結(jié)果

可評(píng)估的52例患者化療前Survivin mRNA表達(dá)水平為0.6012±0.0496,疾病進(jìn)展后Survivin mRNA表達(dá)水平為0.7190±0.0961(P=0.006)。

2.2 預(yù)后因素分析

運(yùn)用Cox回歸模型對(duì)可能影響胃癌患者預(yù)后的各種因素,包括年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Survivin表達(dá)、分期等進(jìn)行回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):分期、Survivin mRNA的表達(dá)水平是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素(表1)。

表1 COX模型篩選的胃癌危險(xiǎn)因素及其參數(shù)

3 討 論

Survivin基因定位于染色體17q25,是凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新成員,Survivin具有抑制細(xì)胞凋亡,調(diào)控細(xì)胞周期及參與血管形成的作用[1-4]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟的復(fù)雜過程。正常細(xì)胞脫離原來組織時(shí),即啟動(dòng)凋亡過程,因而不會(huì)形成遠(yuǎn)隔部位的增殖。癌細(xì)胞從原發(fā)瘤體脫落后,最終形成癌轉(zhuǎn)移,可能有部分是由于Survivin對(duì)癌細(xì)胞凋亡抑制的原因;當(dāng)外周血中的癌細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量,即可體現(xiàn)為Survivin表達(dá)。因而Survivin對(duì)于胃癌的發(fā)生發(fā)展可能是很重要的。

作者的前期研究發(fā)現(xiàn):正常胃炎患者外周血未檢測(cè)到Survivin mRNA的表達(dá),在胃癌患者外周血中Survivin表達(dá)檢測(cè)率為 86.0%,與Survivin在胃癌周圍正常組織中幾乎不表達(dá),而在胃癌組織中100%表達(dá)[5]的研究結(jié)論基本相似。張紅燕等[6]應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)食管癌組織Survivin基因表達(dá)的研究認(rèn)為:Survivin基因在食管癌發(fā)生的早期階段即被激活,因此認(rèn)為其可將作為食管癌發(fā)生早期階段的分子標(biāo)志物。作者應(yīng)用敏感的Real-time RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn):Survivin在胃癌外周血中的表達(dá)是一個(gè)漸進(jìn)的過程,隨著癌前病變向癌浸潤(rùn)及最后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的發(fā)展,Survivin mRNA的表達(dá)水平逐漸增高,說明Survivin mRNA表達(dá)水平是隨著病情的變化而升高,且它的異常表達(dá)發(fā)生在胃癌早期。因此可以認(rèn)為:Survivin可能可以作為胃癌早期診斷的一個(gè)生物分子。

雖然先前有很多與胃癌預(yù)后評(píng)估有關(guān)的分子標(biāo)志報(bào)道,但是能夠真正地成為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素卻不多。Survivin在惡性腫瘤的表達(dá)及預(yù)后評(píng)估的意義也有很多報(bào)道:Bertazza等[7]報(bào)道Survivin在胃癌中的表達(dá)率為98.6%,并且可以預(yù)測(cè)胃癌患者的預(yù)后;Hoffmann等[8]研究認(rèn)為Survivin mRNA高表達(dá)預(yù)示著食管癌患者不良預(yù)后。但是外周血Survivin mRNA表達(dá)與胃癌預(yù)后關(guān)系的探討卻鮮有報(bào)道。本研究顯示:52例可以評(píng)估的患者化療前外周血Survivin mRNA表達(dá)水平較疾病進(jìn)展后的表達(dá)水平低(P<0.05)。運(yùn)用Cox回歸模型進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn):分期、Survivin mRNA的表達(dá)水平是影響胃癌預(yù)后的因素,提示外周血Survivin的檢測(cè)可作為臨床評(píng)估胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

Survivin在正常人的外周血中不表達(dá),而后隨著胃癌的發(fā)生和發(fā)展,它在外周血中表達(dá)水平漸升高,并且影響胃癌患者的預(yù)后,我們認(rèn)為它就可以作為胃癌早期診斷,判斷胃癌預(yù)后的客觀指標(biāo)之一。作者也期待能夠得到大樣本多中心研究結(jié)論的證實(shí),可以使Survivin成為胃癌預(yù)后的一種分子標(biāo)志。

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[3]崔 斐,陳 斌,陳錦章,等.凋亡抑制蛋白Survivin和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(5):761.

[4]張艷萍,石太新,范艷芬,等.凋亡抑制蛋白Survivin在兒童急性白血病中的表達(dá)及臨床意義[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(4):360.

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[6]張紅燕,李珊珊,郝寶嵐.食管癌癌組織中Survivin基因的表達(dá)及臨床意義[J].山東醫(yī)藥,2007,47(26):33.

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[8]Hoffmann A C,Vallbohmer D,Grimminger P,et al.Preoperative survivin mRNA detection in peripheral blood is an independent predictor of outcome in esophageal carcinoma[J].J Pharmacogenomics,2010,11(3):341.