馬 濤， 劉 志

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽 110001)

1000-4718(2012)11-1943-07

2012-05-16

2012-09-17

沈陽市科技計劃(No.F11-264-1-52)；中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院科學(xué)研究基金資助項目(No.fsfh1103)

△通訊作者Tel:024-83282011; E-mail：liuzhicmu2004@yahoo.com.cn

p38 MAPK-HSP27信號通路在內(nèi)毒素致大鼠肺損傷中的作用*

馬 濤， 劉 志△

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，遼寧 沈陽 110001)

目的觀察p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)-熱休克蛋白27(HSP27)信號通路在急性肺損傷病理過程中的變化規(guī)律。方法健康雄性Wistar大鼠(300～320 g)隨機(jī)分成正常對照組(A組)、急性肺損傷組(B組)及急性肺損傷+SB203580組(C組)。通過腹腔注射內(nèi)毒素建立急性肺損傷大鼠模型，分別于實驗開始后的0、2、4、6、8 h處死各組大鼠。檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)白細(xì)胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及BALF中蛋白含量。蘇木素-伊紅(HE)染色檢查肺組織病理變化及免疫熒光方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)F-actin和G-actin，計算肺濕干重比值(W/D)。檢測肺組織中磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)及磷酸化HSP27(p-HSP27)的含量。結(jié)果B組在實驗后2 h BALF中蛋白水平和肺W/D開始明顯增加，給予內(nèi)毒素后8 h肺泡上皮腫脹，肺泡壁增寬，肺泡間質(zhì)和肺泡腔水腫明顯，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白滲出明顯增多，表現(xiàn)出急性肺損傷的病理改變。在給予了p38 MAPK抑制劑SB203580后的C組BALF中蛋白水平及肺W/D分別比B組明顯減少，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白滲出、間質(zhì)與肺泡水腫均較B組減輕。B組均在實驗后2 h血清及BALF中TNF-α和IL-6的濃度開始增加， p-p38 MAPK及p-HSP27的肺內(nèi)表達(dá)開始增加，與A組相比有顯著差異。B組實驗后8 h的F-actin的表達(dá)明顯比A組實驗后0 h及8 h的增加，給予p38 MAPK抑制劑SB203580的C組肺p-HSP27和F-actin的表達(dá)分別比B組明顯減少。結(jié)論內(nèi)毒素可以通過激活p38 MAPK-HSP27信號通路引起急性肺損傷；阻斷該信號通路可以減輕肺損傷。

急性肺損傷； 細(xì)胞因子類； p38絲裂原激活蛋白激酶； 熱休克蛋白27； F-肌動蛋白

急性肺損傷(acute lung injury，ALI) 是指機(jī)體遭受嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等打擊后，出現(xiàn)以彌漫性肺泡毛細(xì)血管膜損傷導(dǎo)致的肺水腫和肺不張為特征的病理狀態(tài)，其最終嚴(yán)重階段是急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI 的發(fā)病機(jī)制有很多研究，至今尚未完全闡明。

肺血管內(nèi)皮細(xì)胞襯于血管壁內(nèi)表面，是血管壁與血液間的分界細(xì)胞，其形態(tài)結(jié)構(gòu)受損或功能改變導(dǎo)致血管內(nèi)皮屏障功能的損害，促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞骨架與血管內(nèi)皮通透性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，對于維持內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能有重要意義。纖維狀肌動蛋白(F-actin)是細(xì)胞骨架中的主要收縮蛋白，增加其含量可以使內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加，導(dǎo)致血管屏障功能的損害[1-2]。熱休克蛋白27(heat-shock protein 27，HSP27) 作為一種重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)可被p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)信號途徑磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合/解聚過程，使肌動蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生重組，促進(jìn)急性肺損傷的發(fā)生[3-4]。

我們擬通過腹腔注射內(nèi)毒素(脂多糖，lipopolysaccharide，LPS)建立急性肺損傷大鼠模型，觀察p38 MAPK-HSP27信號通路在急性腎損傷誘發(fā)急性肺損傷過程中的變化規(guī)律，為急性肺損傷的預(yù)防、早期診治提供實驗及理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

健康雄性Wistar大鼠,體重300～320 g，由中國醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。所用儀器包括便攜式心電監(jiān)護(hù)儀、高速離心機(jī)。5%水合氯醛、大鼠IL-6和TNF-α檢測的ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)公司。SB203580購自碧云天公司。p38 MAPKⅠ抗、 p-p38 MAPKⅠ抗、HSP27Ⅰ抗和p-HSP27Ⅰ抗均購自Santa Cruz。G-actin染色液(Alexa Fluor? 594 conjugate deoxyribonuclease I)、F-actin染色液(Alexa Fluor? 488 phalloidin)和細(xì)胞核染色液(DAPI)均購自Invitrogen。

2方法

2.1動物模型制備和分組 健康雄性Wistar大鼠(300～320 g)，予5%水合氯醛300 mg /kg腹腔麻醉，氣管切開，頸動、靜脈穿刺，留置導(dǎo)管。監(jiān)測呼吸頻率、心率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓及中心靜脈壓。大鼠的狀態(tài)穩(wěn)定0.5 h 后，隨機(jī)分成3組。A組: 正常對照組，給予腹腔注射生理鹽水4 mL；B組:LPS組，給予腹腔注射生理鹽水2 mL和LPS(5 mg/kg) 2 mL；C組:LPS+SB203580組，給予腹腔注射p38 MAPK的專一抑制劑 SB203580 2 mL和LPS(5 mg/kg) 2 mL。

2.2標(biāo)本收集與檢測 造模后，分別于實驗開始后的0、2、4、6和8 h處死各組大鼠，每個時點處死6只大鼠。所有大鼠處死后留取靜脈血標(biāo)本測定血中細(xì)胞因子。開胸暴露兩肺，先觀察肺臟大體改變，結(jié)扎右肺門，取右上肺，用4%多聚甲醛固定；常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下檢查肺組織病理變化；取右下肺，用濾紙吸去右肺下葉血，稱濕重后，置烤箱中(80 ℃、72 h)烤至恒重，稱干重，計算肺濕干重比(wet/dry weight ratio,W/D)。左側(cè)肺行支氣管肺泡灌洗，每次用3mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)灌洗左肺，共3次，合并3次收集到的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 凍存待測細(xì)胞因子。用考馬斯亮藍(lán)法測定BALF中蛋白含量。

2.3HE染色 肺組織常規(guī)固定、脫水、包埋、切片后制作HE切片，每張HE染色切片隨機(jī)選取多個高倍鏡視野，觀察并比較肺組織細(xì)胞的改變。

2.4IL-6和TNF-α含量的檢測 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測血清和BALF中的TNF-α和IL-6的濃度。檢測步驟按照試劑盒說明書操作。

2.5Western blotting檢測p38 MAPK、 p-p38 MAPK、HSP27及 p-HSP27 開胸取出右肺中葉，迅速液氮凍存，制備勻漿，提取蛋白，測定蛋白濃度后，然后保存于-80 ℃待用。取100 μg 的蛋白樣品于12% SDS-PAGE 凝膠中進(jìn)行電泳，待目的蛋白接近凝膠底部時停止電泳，4 ℃、120 V恒壓電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。分別加入1∶1 000稀釋的p38 MAPK、 p-p38 MAPK、HSP27及 p-HSP27 Ⅰ抗和1∶500 稀釋的GAPDH (內(nèi)參)Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶1 000)室溫孵育1 h后發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，實驗結(jié)果采用Quantity One軟件分析，掃描吸光度(A)值。

2.6免疫熒光法檢測內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)F-actin和G-actin (1)石蠟標(biāo)本切片，烘烤2 h左右，脫蠟水化(依次經(jīng)二甲苯，污水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，75%乙醇，PBS)；(2)抗原修復(fù)(檸檬酸緩沖液高溫高壓修復(fù))；(3)1×PBS緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)洗滌3次，每次5 min；(4)滴加非免疫山羊血清(內(nèi)含0.3%Triton X-100)封閉液，覆蓋液面2～3 mm，室溫放置60 min，甩去多余液體;(5)滴加200 μL F-actin染色(0.165 mol/L)和G-actin染色液(0.3 μmol/L)染色15～20 min；(6)PBS洗3次各5 min；(7)滴加200 μL DAPI染色液染色3 min；(8)PBS洗3次各5 min；(9)熒光顯微鏡下觀察、拍照，F(xiàn)-actin和G-actin分別為綠色和紅色熒光，細(xì)胞核為藍(lán)色熒光；(10)采用MOTIC FLUO 1.0 分析軟件對圖片進(jìn)行區(qū)域亮度分析，比F與G肌動蛋白熒光亮度的比值來進(jìn)行半定量分析。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1大鼠BALF中蛋白水平和肺W/D的改變

從表1可以看出，A組在實驗后BALF中蛋白水平和肺W/D無明顯變化。B組在實驗后2 h BALF中蛋白水平和肺W/D開始增加，與A組比較明顯差異。C組BALF中蛋白水平和肺W/D比B組明顯減少(P<0.05)。

表1大鼠支氣管肺泡灌洗液中蛋白水平和肺濕干重比的改變

GroupBALFproteinW/D0h2h4h6h8h0h2h4h6h8hA1．463±0．0121．463±0．0191．461±0．0211．461±0．0161．461±0．0114．267±0．0214．253±0．0184．298±0．0124．405±0．0104．490±0．014B1．463±0．0121．452±0．012?1．643±0．014?1．842±0．012?1．941±0．021?4．267±0．0214．502±0．012?4．937±0．016?5．148±0．021?5．353±0．023?C1．463±0．0121．462±0．021#1．462±0．019#1．573±0．025#1．630±0．024#4．267±0．0214．400±0．014#4．860±0．017#5．034±0．032#5．125±0．020#

*P<0.05vsA group；#P<0.05vsB group.

2血清和BALF中TNF-α和IL-6的濃度

如表2、3所示，B組大鼠血清和BALF中TNF-α和IL-6的濃度在實驗后2 h開始增加，與A組相比差異顯著(P<0.05)。C組大鼠血清和BALF中TNF-α和IL-6的濃度在實驗后2 h也開始增加，但沒有B組增加得更明顯，與A、B組相比均有顯著差異(P<0.05)。

表2 大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中TNF-α的濃度

*P<0.05vsA group；#P<0.05vsB group.

表3 大鼠血清和支氣管肺泡灌洗液中IL-6的濃度

*P<0.05vsA group；#P<0.05vsB group.

3LPS和SB203580對大鼠肺病理學(xué)變化的影響

正常對照組0 h與8 h肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡內(nèi)無明顯滲出，無肺間質(zhì)水腫表現(xiàn)。LPS組肺泡上皮腫脹，肺泡壁增寬、毛細(xì)血管擴(kuò)張和充血，肺泡間質(zhì)和肺泡腔水腫明顯，肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白滲出明顯增多，大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分視野可見小呼吸道損傷，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)出急性肺損傷的病理改變。在給予p38 MAPK抑制劑SB203580后的C組內(nèi)可見肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞、紅細(xì)胞和蛋白滲出,間質(zhì)與肺泡水腫均較B組減輕，見圖1。

4大鼠p-p38MAPK的表達(dá)

B、C組在實驗后2 h p-p38 MAPK的條帶濃度開始增加,但C組明顯比B組濃度減低。半定量分析顯示A組在實驗后p-p38 MAPK無明顯變化。B、C組在實驗后2 h p-p38 MAPK開始增加，與A組比較有明顯差異(P<0.05)。C組與B組相比明顯表達(dá)減低 (P<0.05)，見圖2。

Figure 1. HE staining of rat lung tissues (×400).

圖1大鼠肺組織HE染色結(jié)果

圖2不同時點p-p38MAPK的表達(dá)

5大鼠p-HSP27的表達(dá)

Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，B組在實驗后2 h p-HSP27的條帶濃度開始增加，C組的條帶濃度比B組小 。B組在實驗后2 h p-HSP27的肺內(nèi)表達(dá)開始增加，與A組相比顯著差異(P<0.05)。在給予了p38 MAPK抑制劑SB203580后的C組肺p-HSP27的表達(dá)比B組明顯減少(P<0.05)，見圖3。

圖3不同時點磷酸化熱休克蛋白27的表達(dá)

6免疫熒光法檢測F-actin和G-actin的表達(dá)水平

圖4顯示B組F-actin的表達(dá)比正常對照組0 h及8 h的表達(dá)明顯增加，p38 MAPK抑制劑SB203580 處理后C組F-actin的表達(dá)分別比B組減少。各組免疫熒光檢測結(jié)果的半定量分析顯示，B組均在損傷后2 h F-actin/G-actin比值開始增加，與正常對照組相比顯著差異(P<0.05)。給予p38 MAPK抑制劑SB203580后的C組F-actin/G-actin比值比B組明顯減少(P<0.05)。

討 論

內(nèi)毒素是一些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，其致傷作用主要在于它的始動作用。注射內(nèi)毒素后，其對肺臟的直接損傷作用較少，起致傷作用的主要是它誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。多種炎癥細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞激活后，釋放大量炎癥介質(zhì)或細(xì)胞因子等，造成肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，通過大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后，大鼠體內(nèi)炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6的增加，BALF中蛋白含量增加，肺W/D增加，HE染色顯示肺泡內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)出了典型的急性肺損傷的表現(xiàn)。急性肺損傷是各種直接或間接致傷因素?fù)p傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全。其基本病理特征是肺部的急性炎癥和肺微血管通透性增加[5-7]。肺內(nèi)皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞屏障完整性與功能受損是急性肺損傷的一個重要特征。細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)由細(xì)胞骨架維持，細(xì)胞骨架是維持細(xì)胞正常形態(tài)與功能的重要結(jié)構(gòu)。微絲是細(xì)胞骨架的一種重要類型，由肌動蛋白構(gòu)成，主要由F-肌動蛋白和肌動蛋白結(jié)合蛋白組成，其聚合/解聚過程與細(xì)胞的許多功能活動相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素引起了肺內(nèi)F-肌動蛋白濃度增加，這說明內(nèi)毒素引起了肺內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)F-肌動蛋白開始聚合，應(yīng)力纖維形成，細(xì)胞骨架發(fā)現(xiàn)改變。細(xì)胞內(nèi)中心張力增加，細(xì)胞收縮，細(xì)胞間縫隙形成，肺微血管通透性增加，引起了肺損傷的發(fā)生[8-9]。

另外本研究發(fā)現(xiàn)通過大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后，引起大鼠BALF中炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6的增加,同時大鼠肺內(nèi)p-p38 MAPK含量也相應(yīng)逐漸增加，這表明內(nèi)毒素引起p38 MAPK的激活可能與TNF-α和IL-6相關(guān)[10-11]。同時在實驗中也發(fā)現(xiàn)如給予p38 MAPK抑制劑SB203580，肺內(nèi)炎癥介質(zhì)水平也相應(yīng)減低，這說明p38 MAPK也可能參與調(diào)節(jié)著炎癥介質(zhì)的激活[3,12]。MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要的信號系統(tǒng)，調(diào)控細(xì)胞增生、分化、凋亡、基因表達(dá)等。p38 MAPK是MAPK家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，紫外線照射、促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6)、低氧、高滲環(huán)境、蛋白合成抑制劑、缺血、再灌注以及脂多糖等均可激活p38 MAPK[3,12]。p38 MAPK磷酸化后，調(diào)節(jié)下游的絲裂原活化蛋白激酶激活蛋白激酶2激酶和HSP27。

圖4肺內(nèi)皮細(xì)胞F-actin和G-actin的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)p- HSP27表達(dá)水平隨著p-p38 MAPK的增加而增加，呈正相關(guān)趨勢，且如使用p38 MAPK阻斷劑SB203580，則p-p38 MAPK和p-HSP27表達(dá)水平下降，這證明p38 MAPK調(diào)控著p-HSP27的表達(dá)。HSP27作為一種重要的肌動蛋白結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架重組方面發(fā)揮著重要的作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)非磷酸化狀態(tài)存在的HSP27作為帽狀蛋白結(jié)合在F-肌動蛋白的正極[13]，抑制肌動蛋白的聚合。p38 MAPK磷酸化調(diào)節(jié)下游的MK2 激酶、HSP27，使與F-肌動蛋白正極結(jié)合的HSP27在15、78 和82 位的絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致HSP27從F-肌動蛋白正極解離進(jìn)入胞漿，從而使F-肌動蛋白正極暴露。此時，游離的F-肌動蛋白正極能夠與G-肌動蛋白結(jié)合， 其結(jié)果是F-肌動蛋白發(fā)生聚合而延長[14-16]，進(jìn)而使肌動蛋白細(xì)胞骨架得以重組，細(xì)胞間隙增大，導(dǎo)致肺內(nèi)皮-上皮細(xì)胞屏障功能受損，進(jìn)而引起急性損傷的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)隨著磷酸化HSP27表達(dá)水平的增加，肌動蛋白F/G比值、BALF中蛋白濃度及肺W/D也相應(yīng)增加，肺損傷程度也相應(yīng)增加。這也證實了磷酸化的HSP27調(diào)控肌動蛋白的聚合，促進(jìn)F-actin延長，延長的F-actin引起了細(xì)胞間連接改變，促進(jìn)肺內(nèi)皮細(xì)胞-上皮細(xì)胞屏障完整性與功能受損傷。

我們通過實驗發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素引起細(xì)胞因子TNF-α和IL-6增加，同時體內(nèi)p-p38 MAPK、p-HSP27和肌動蛋白F含量也逐漸增加，引起急性肺損傷的發(fā)生。如使用p38 MAPK阻斷劑SB203580，則p-HSP27表達(dá)水平下降和肌動蛋白F含量增加的趨勢減緩，同時肺損傷的程度也相應(yīng)減輕。這可能是由于大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)等激活p38 MAPK，之后移位至細(xì)胞核內(nèi)，通過調(diào)節(jié)下游蛋白HSP27活性而誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)F-actin 的再生和重組，使細(xì)胞間聯(lián)系改變，進(jìn)一步影響通透性。這表明p38 MAPK- HSP27信號通路在大鼠腹腔注射內(nèi)毒素后致急性肺損傷過程中發(fā)揮了重要作用。

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Roleofp38MAPK-HSP27signalingpathwayinratacutelunginjuryinducedbylipopolysaccharide

MA Tao, LIU Zhi

(DepartmentofEmergencyMedicine,theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.E-mail:liuzhicmu2004@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the role of p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK)-heat-shock protein 27 (HSP27) signaling pathway in lipopolysaccharide-induced acute lung injury (ALI) in rats.METHODSWistar rats were randomly divided into control group, ALI group and ALI+SB203580 group. After the experimental model was established, the rats were sacrificed. The pathological changes of the lung and the changes of F-actin and G-actin in the endothelial cells were observed. The ratio of wet weight to dry weight (W/D) of the lung tissues was measured. The protein levels in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were detected. The levels of IL-6 and TNF-α in serum and BALF were tested. The concentrations of p-p38 and p-HSP27 in the lung were determined.RESULTSIn ALI group, the protein levels in BALF and W/D ratio of the lung increased significantly at 2 h. The levels of TNF-α and IL-6 in serum and BALF began to increase at 2 h, which had significant difference as compared with control group. Aleolar epithelial swelling, alveolar walls widening, alveolar interstitial and cavity edema, and the exudation of alveolar inflammation cells, red blood cells and protein were observed in ALI group. The protein levels in BALF and W/D ratio of the lung in ALI+SB203580 group were much less than those in ALI group. The exudation of alveolar inflammation cells, red blood cells and protein, and the interstitial and alveolar edema in ALI+SB203580 group alleviated as compared with ALI group. The expression of p-p38 MAPK and p-HSP27 in the lung at 2 h in ALI group was higher than that in control group. F-actin expression in ALI group obviously increased than that in control group at time points of 0 h and 8 h. Compared with ALI group, the expression of p-HSP27 and F-actin in ALI+SB203580 group was reduced.CONCLUSIONLipopolysaccharide activates p38 MAPK-HSP27 signaling pathway and induces lung injury. Blockage of p38 MAPK-HSP27 signaling pathway may reduce lung injury.

Acute lung injury; Cytokines; p38 mitogen-activated protein kinase; Heat-shock protein 27; F-actin

R563.8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.11.005