郭曉芳，顧 勤，劉 寧，俞 隼

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院ICU，江蘇 南京 210008)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是臨床常見的危急重癥，死亡率在50%以上[1]。盡管現(xiàn)代救治技術(shù)不斷提高，在預(yù)防AKI及保護(hù)腎臟方面尚無有效手段，AKI發(fā)生率及其相關(guān)死亡率并未降低。有研究表明，細(xì)胞凋亡參與了甘油、內(nèi)毒素等誘導(dǎo)AKI的發(fā)生[2－3]，且受多種凋亡基因及其相關(guān)蛋白的調(diào)控，其中P53被認(rèn)為是最重要的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因[4]。因此，本研究通過腎臟缺血再灌注建立AKI模型觀察腎組織細(xì)胞凋亡變化及P53蛋白的表達(dá)，為缺血再灌注導(dǎo)致的AKI分子機(jī)制的研究提供依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠18只，體重18 ～23 g，平均體重(20.03 ±0.98)g，由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供。

1.2 主要試劑 P53抑制劑pifithrin－alpha(PFT－α;Calbiochem)，抗 P53和腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)多克隆抗體(Santa Cruz)，GAPDH(BD)，抗 Bcl－2 和 caspase－3(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，免疫組化S－P超敏試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TUNEL試劑盒(Roche)，BCA蛋白試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，RIPA裂解液(南京七彩石生物科技有限公司)，蛋白marker(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)，大鼠抗羊Ⅱ抗(Abcam)，PVDF膜(Milipore)，顯影液(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，免疫熒光Ⅱ抗(Molecular Probes)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型和組織標(biāo)本制作

2.1.1 動(dòng)物模型的建立 所有小鼠均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)(標(biāo)準(zhǔn)溫度、濕度、12 h明暗周期、可自由攝食);隨機(jī)分為3組(n=6):假手術(shù)組、AKI組和PFT－α組。AKI組采用改良方法建立小鼠 AKI模型[5]:腹腔注射氯胺酮(2 mL/kg)麻醉小鼠，無菌條件下背部正中行長約1.5 cm的縱形切口，鈍性分離并暴露雙側(cè)腎臟，游離出雙側(cè)腎蒂，無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷血流，腎臟由紅變紫黑色表示夾閉成功，持續(xù)夾閉45 min后開放動(dòng)脈夾，腎臟恢復(fù)灌注后縫合切口。假手術(shù)組同法找到腎蒂，但不夾閉腎蒂。PFT－α組于建立AKI模型前5 min腹腔注射 PFT－α 2.2 mg/kg[6]。術(shù)后小鼠于24～29℃的環(huán)境，密切觀察小鼠的生命體征，同時(shí)補(bǔ)充水與飼料。

2.1.2 模型成功判定標(biāo)準(zhǔn) 參考 Melnikov等[5]的方法，松開動(dòng)脈夾后腎臟從紫黑色轉(zhuǎn)為紅色，則說明小鼠經(jīng)過腎臟缺血－再灌注病理生理過程，關(guān)腹后繼續(xù)觀察2 h，如動(dòng)物能正?；顒?dòng)，則認(rèn)為造模成功;如果松開動(dòng)脈夾后5 min，腎臟未轉(zhuǎn)為紅色或術(shù)中損傷大血管或者周圍組織認(rèn)為造模不成功。

2.1.3 標(biāo)本制作 于造模后48 h，摘除眼球取外周靜脈血約1 mL，測定血尿素氮、肌酐;摘取雙腎，取部分腎組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后，用于HE染色、TUNEL法檢測凋亡小體及免疫組化法測定Bcl－2、caspase－3和TNFR蛋白水平，其余腎組織－80℃保存，用于P53蛋白含量測定。

2.2 標(biāo)本檢測方法

2.2.1 血尿素氮和肌酐測定 靜脈血1 mL置于惰性分離膠促凝管，快速離心后取上層血清，采用日本日立公司全自動(dòng)生化檢測儀檢測尿素氮和肌酐值。

2.2.2 腎組織HE染色及腎組織評(píng)分 取部分腎組織經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋制作石蠟切片，HE染色后光鏡觀察各組腎組織病理形態(tài)學(xué)變化。腎組織病理評(píng)分參照Paller等[7]評(píng)分。

2.2.3 Western blotting法檢測腎組織P53蛋白 腎組織稱重后剪碎勻漿，RIPA裂解液裂解，離心，取上清采用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品加5×SDS加樣緩沖液，加熱蛋白變性后電泳，在膠上加入標(biāo)準(zhǔn)參照蛋白。封閉，先后加入Ⅰ抗溶液(P531∶3000，GAPDH 1∶3000)、Ⅱ抗(P531∶2000，GAPDH 1∶2000)。洗膜，進(jìn)行 ECL 反應(yīng)，之后定影、顯影。

2.2.4 免疫熒光定位 P53表達(dá) 4 μm厚冰凍切片，丙酮固定PBS洗5 min×2次;修復(fù)后置于3%H2O2甲醇溶液室溫孵育10 min，加Ⅰ抗P53多克隆抗體(濃度1∶1000)，陰性對(duì)照用PBS替代Ⅰ抗，4℃過夜，加Ⅱ抗FITC熒光素標(biāo)記的大鼠抗羊免疫球蛋白IgG(濃度1∶500)，37℃避光孵育1 h，甘油封固，熒光顯微鏡下觀察。P53由于被間接FITC標(biāo)記發(fā)藍(lán)綠色光。

2.2.5 TUNEL法檢測腎組織凋亡細(xì)胞 切片常規(guī)脫蠟入水，PBS洗5min×3次，加20%正常牛血清室溫30 min，將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90 min，之后PBS洗5min×3次，3%H2O2甲醇液室溫阻斷10 min，37℃溫育90 min，加POD轉(zhuǎn)化劑37℃溫育30 min，DAB/H2O2顯色。結(jié)果判定:細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞。凋亡指數(shù)計(jì)算方法:數(shù)5個(gè)高倍視野，分別計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù) ×100%。

2.2.6 免疫組化法檢測腎組織 Bcl－2、TNFR和caspase－3 石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，浸入3%H2O2中10 min，加正常山羊血清封閉20 min后，依次加Ⅰ抗 (抗 Bcl－2、TNFR和 caspase－3多克隆抗體)(1∶200)50 μL，生物素標(biāo)記Ⅱ抗 50 μL，室溫孵育 30 min，DAB顯色。蘇木精復(fù)染、脫水、透明及封片后鏡檢。細(xì)胞染色呈棕黃色為陽性，定位于細(xì)胞漿或細(xì)胞核。胞漿染色結(jié)果判定:無著色0分;淡黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色3分。計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野(×200)下陽性細(xì)胞所占的百分比，無著色細(xì)胞為0分;≤10%為1分;11%～50%為2分;51%～75%為3分;＞75%為4分。計(jì)算兩部分相乘結(jié)果。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 腎功能變化

PFT－α組和AKI組小鼠血尿素氮和肌酐水平明顯高于假手術(shù)組，而PFT－α組與AKI組比較，血尿素氮和肌酐水平明顯降低(P＜0.05)，見表1。

表1 各組血尿素氮、血清肌酐、腎小管評(píng)分和凋亡指數(shù)的比較Table1.The results of blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(SCr)，tubular score and apoptotic index in each group(.n=6)

表1 各組血尿素氮、血清肌酐、腎小管評(píng)分和凋亡指數(shù)的比較Table1.The results of blood urea nitrogen(BUN)，serum creatinine(SCr)，tubular score and apoptotic index in each group(.n=6)

*P ＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs AKI group.

Group BUN(mmol/L) SCr(μmol/L) Tubular score Apoptoic index(%)Sham 15.42 ±5.08 4.33±1.86 0.17±0.41 0.67±0.58 AKI 77.78 ±5.82* 152.00±16.55* 4.50±0.55* 28.00±2.01*PFT －α 61.65 ±3.06*# 74.33±9.83*# 2.83±0.41*# 5.00±1.04*#

2 腎組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組腎組織無明顯病變;AKI組光鏡下見皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞空泡、滴狀變性，刷狀緣消失，有明顯淤血帶;PFT－α組光鏡下見皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞空泡，滴狀變性減少，淤血帶明顯減輕，造模后48 h Paller病理評(píng)分明顯低于AKI組(P ＜0.05)，見圖1、表1。

Figure1.The pathophysiological changes in the kidney of mice(HE staining，× 200).A:sham group;B:AKI group;C:PET－α group.圖1 各組小鼠腎皮質(zhì)組織病理

3 腎組織P53表達(dá)

P53在假手術(shù)組有少量表達(dá)，而AKI組在缺血再灌注48 h后腎臟P53蛋白明顯增加[(1.08±0.53)vs(4.54 ±0.88)，P ＜0.05]，見圖 2，且主要定位于腎皮質(zhì)，皮－髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)區(qū)的腎小管和集合管分布較少，見圖3。而P53在PFT－α組小鼠腎臟表達(dá)較 AKI組明顯減少[(1.08±0.78)vs(4.54 ±0.88)，P ＜0.05]，見圖 2。

Figure2.The level of P53 protein in each group.圖2 各組小鼠腎組織P53蛋白水平

4 腎組織細(xì)胞凋亡

假手術(shù)組小鼠腎臟未見凋亡細(xì)胞，AKI組與PFT－α組小鼠腎組織均可見凋亡細(xì)胞，而PFT－α組與AKI組比較腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P＜0.05)，見圖4。AKI組小鼠腎組織凋亡細(xì)胞多位于皮質(zhì)，皮－髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)區(qū)腎小管和集合管分布較少，與腎臟P53的表達(dá)部位一致，見圖5、表1。

Figure3.The results of P53 protein immunofluorescence staining in the kidney of AKI group(×200).A:cortex;B:cortex－medulla junction;C:medulla.圖3 AKI組腎組織P53蛋白免疫熒光

Figure4.The apoptotic cells in the kidney of mice were detected by TUNEL in each group(×200).A:sham group;B:AKI group;C:PET－α group.圖4 各組腎組織凋亡細(xì)胞TUNEL檢測

Figure5.The apoptotic cells were detected by TUNEL in AKI group(×200).A:cortex;B:cortex－medulla junction;C:medulla.圖5 AKI組腎組織凋亡細(xì)胞TUNEL檢測

5 腎組織TNFR、Bcl－2和caspase－3蛋白含量

各組小鼠腎組織均見TNFR、Bcl－2和 caspase－3蛋白表達(dá)。與假手術(shù)組相比，AKI組小鼠腎臟TNFR 和 caspase－3蛋白水平升高(P ＜0.05)，Bcl－2蛋白水平降低(P＜0.05)。而 PFT－α組與 AKI組比較 TNFR和 caspase－3蛋白水平降低(P＜0.05)，Bcl－2 蛋白水平升高(P ＜0.05)，見圖 6、表2。

討 論

Figure6.The expression of TNFR，caspase－3 and Bcl－2 proteins in the kidney of mice were detected by immunohistochemical staining(×200).圖6 各組小鼠腎組織TNFR、caspase－3及Bcl－2蛋白的表達(dá)

表2 各組小鼠腎組織TNFR、caspase－3和Bcl－2蛋白的表達(dá)Table2.The expression of TNFR，caspase－3 and Bcl－2 protiens in each group(.n=6)

表2 各組小鼠腎組織TNFR、caspase－3和Bcl－2蛋白的表達(dá)Table2.The expression of TNFR，caspase－3 and Bcl－2 protiens in each group(.n=6)

*P ＜0.05 vs sham group;#P ＜0.05 vs AKI group.

Group TNFR Caspase－3 Bcl－2 Sham 1.67 ±0.82 2.00 ±0.89 10.50 ±1.38 AKI 9.75 ±0.76*11.00 ±1.26* 1.83 ±0.98*PFT － α 5.55 ±0.82*#7.00 ±1.26*#5.83 ±0.75*#

休克、創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染、燒傷等患者由于經(jīng)歷缺血再灌注損傷，可導(dǎo)致急性腎功能衰竭，對(duì)于危重患者而言，缺血再灌注是急性腎損傷發(fā)生的重要病理生理機(jī)制，過去認(rèn)為急性腎小管壞死是AKI發(fā)生的主要病理改變[8]。由于近年來臨床活檢和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)輕度急性腎小管壞死與臨床表現(xiàn)的腎功能障礙程度之間不一致，推測除腎小管細(xì)胞壞死以外還存在其它腎小管上皮細(xì)胞丟失的途徑[9]。本研究結(jié)果表明，正常小鼠腎臟組織未出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，夾閉腎動(dòng)脈再開放后腎臟凋亡細(xì)胞明顯增加，且腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落、空泡及滴狀變性，皮髓質(zhì)間有明顯淤血帶，腎臟組織具有明顯病理改變。因此認(rèn)為，腎臟缺血再灌注時(shí)，細(xì)胞凋亡是腎功能喪失的重要途徑，參與介導(dǎo)急性腎損傷的發(fā)生[10]。正常情況下約94%血液供應(yīng)皮質(zhì)層，5%供應(yīng)外髓質(zhì)，其余不到1%供應(yīng)內(nèi)髓，腎損傷時(shí)腎臟血流減少的部位主要在皮質(zhì)，因此皮質(zhì)相對(duì)髓質(zhì)對(duì)缺血敏感性高。本研究發(fā)現(xiàn)AKI組小鼠腎臟凋亡細(xì)胞主要集中于皮質(zhì)，缺血再灌注致急性腎損傷易于發(fā)生細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡受多種凋亡基因及其相關(guān)蛋白的調(diào)控，p53被認(rèn)為是最重要的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因[4]。缺血、缺氧等應(yīng)激刺激P53蛋白富集，激活相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)或作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游凋亡基因表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。本研究結(jié)果證實(shí)腎臟缺血再灌注刺激P53表達(dá)及凋亡小體增加，且二者表達(dá)部位一致，均主要分布于皮質(zhì)，因此推測急性腎損傷時(shí)，腎組織P53表達(dá)增加，可能參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了明確P53蛋白與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射P53特異性抑制劑PFT－α，觀察腎臟細(xì)胞凋亡及腎功能變化。PFT－α通過特異性抑制P53依賴誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，近年來在抑制抗腫瘤治療的副作用及研究P53功能方面受到廣泛關(guān)注[11－12]。本實(shí)驗(yàn)于小鼠腎動(dòng)脈夾閉前5 min腹腔注射PFT－α 2.2 mg/kg[6]，發(fā)現(xiàn)與 AKI組相比，PFT － α 組小鼠腎組織P53表達(dá)下降，腎臟細(xì)胞凋亡指數(shù)降低85.7%，腎功能指標(biāo)血尿素氮和肌酐水平分別降低20.7%和48.3%，表明腎臟缺血再灌注時(shí)，P53表達(dá)增加，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與AKI的發(fā)生。

目前公認(rèn)的2條細(xì)胞凋亡通路均有P53蛋白的參與，即線粒體凋亡通路和死亡受體通路，前者通過激活Bcl－2家族成員中促凋亡基因bax表達(dá)，抑制抗凋亡基因bcl－2的表達(dá)，引起線粒體細(xì)胞色素C向胞質(zhì)內(nèi)釋放;后者通過細(xì)胞表面死亡受體如TNF－α和其配基TNFR結(jié)合，2條通路最終激活凋亡蛋白執(zhí)行酶caspase－3(共同通路)，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。Cunningham等[13]通過膿毒癥導(dǎo)致的AKI模型發(fā)現(xiàn)，P53及死亡受體通路中表面受體配基TNFR蛋白在AKI腎組織的近曲小管周圍表達(dá)增加，同時(shí)TUNEL法檢測腎小管周圍凋亡小體增多且與腎功能下降程度呈正相關(guān)。也有研究報(bào)道[14]，順鉑可上調(diào)小鼠TNFR及P53蛋白在腎臟的表達(dá)，腎功能障礙程度、細(xì)胞凋亡指數(shù)升高，表明P53蛋白通過激活細(xì)胞凋亡的死亡受體通路參與了膿毒癥相關(guān)AKI、腎毒性藥物順鉑所致AKI的病理過程。本實(shí)驗(yàn)通過夾閉小鼠腎動(dòng)脈再開放建立缺血再灌注模型，研究各組小鼠腎組織Bcl－2、TNFR和caspase－3蛋白水平，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，AKI組P53表達(dá)增加，同時(shí)線粒體凋亡通路中抗凋亡蛋白Bcl－2水平降低，表面受體通路配基TNFR蛋白及二者共同通路凋亡執(zhí)行蛋白酶caspase－3蛋白水平升高;建模前給予PFT－α后P53表達(dá)降低，同時(shí)Bcl－2蛋白水平升高，TNFR和caspase－3蛋白水平降低，表明腎臟缺血再灌注時(shí)，P53表達(dá)增加，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡的線粒體和死亡受體通路，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

另外PFT－α組小鼠在腹腔注射PFT－α后小鼠腎功能、腎臟組織病理學(xué)并未恢復(fù)至正常水平，原因可能為介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，涉及到多種促凋亡基因表達(dá)，除了P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路外，還存在非依賴P53蛋白介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑。

腎臟缺血再灌注時(shí)，P53通過干預(yù)細(xì)胞凋亡的線粒體凋亡通路和表面受體通路，主要定位表達(dá)皮質(zhì)近曲小管，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，影響腎功能，參與AKI的發(fā)生。通過干預(yù)細(xì)胞凋亡途徑減輕腎小管損傷，為治療缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷提供了特異性治療策略。

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