徐柯樂， 陳 勤， 劉 偉， 姚媛媛， 夏醒醒， 張蓓蕾， 李燕斐

(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230039)

1000-4718(2012)09-1605-05

2012-04-02

2012-05-15

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No.KJ2009A116;No.KJ2011068)；安徽省教育廳省級(jí)《細(xì)胞生物學(xué)》精品課程項(xiàng)目(No.2009024);教育部大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(No.2041044)

△通訊作者 Tel：0551-5108552；E-mail：chenqin169@163.com

遠(yuǎn)志皂苷減輕Aβ1-40誘導(dǎo)的AD大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白Ser396位點(diǎn)的過度磷酸化*

徐柯樂， 陳 勤△， 劉 偉， 姚媛媛， 夏醒醒， 張蓓蕾， 李燕斐

(安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230039)

目的探討遠(yuǎn)志皂苷對(duì)β-淀粉樣肽1-40(Aβ1-40)誘導(dǎo)的阿爾茨海默病(AD)大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化的影響。方法大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ1-40建立AD模型，并用遠(yuǎn)志皂苷(18.5 mg/kg、37.0 mg/kg和74.0 mg/kg)對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃治療；免疫組織化學(xué)染色法觀察大腦神經(jīng)元中總tau蛋白、p-tau(Ser396)、蛋白激酶A(PKA)和蛋白磷酸酶2A(PP2A)蛋白的表達(dá)；蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)大腦神經(jīng)元中總tau蛋白含量、tau蛋白Ser396位點(diǎn)磷酸化以及PKA、PP2A蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比，Aβ1-40組大腦神經(jīng)元中總tau蛋白含量、tau蛋白Ser396位點(diǎn)磷酸化水平和PKA蛋白的表達(dá)水平顯著升高，而PP2A蛋白的表達(dá)水平明顯降低。與Aβ1-40組相比，遠(yuǎn)志皂苷各治療組大鼠大腦神經(jīng)元中總tau蛋白含量、tau蛋白Ser396位點(diǎn)磷酸化水平和PKA蛋白表達(dá)水平下降明顯，而PP2A蛋白表達(dá)水平顯著升高。結(jié)論遠(yuǎn)志皂苷可能是通過下調(diào)PKA蛋白表達(dá)量，上調(diào)PP2A蛋白表達(dá)量，減輕AD大鼠腦神經(jīng)元中tau蛋白Ser396位點(diǎn)的過度磷酸化，使神經(jīng)細(xì)胞免遭Aβ1-40的毒害。

遠(yuǎn)志皂苷； β-淀粉樣肽； 阿爾茨海默?。?大鼠； Tau蛋白； 磷酸化

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種常見于老年人群中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行疾病。尸解發(fā)現(xiàn)其主要病理特征為老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等[1]。研究發(fā)現(xiàn)NFTs的主要成分是過度磷酸化的tau蛋白，正常水平磷酸化的tau 蛋白對(duì)于微管的組裝和穩(wěn)定有著重要作用，而過度磷酸化的tau蛋白則喪失其生理功能，導(dǎo)致微管解聚和細(xì)胞骨架損毀，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Tau蛋白的磷酸化水平受到細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶A(protein kinase A，PKA) 和蛋白磷酸酶2A(Aprotein phosphatase 2A，PP2A)的共同調(diào)節(jié)。中藥遠(yuǎn)志的主要藥用成分是遠(yuǎn)志皂苷(tenuigenin，TEN)，藥理和臨床研究表明，其具有改善記憶、抗氧化、抗衰老、強(qiáng)心、降壓及抗癡呆的作用[2]。本室前期實(shí)驗(yàn)已證明[3-6]，TEN對(duì)腦內(nèi)注射β-淀粉樣肽1-40(amyloid β-peptide 1-40,Aβ1-40)的AD大鼠和小鼠的學(xué)習(xí)記憶均有顯著的改善效應(yīng)，并證明其對(duì)Aβ1-40誘導(dǎo)的原代神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)毒性有一定的治療效果。但TEN對(duì)Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠腦神經(jīng)元中tau蛋白磷酸化是否有干預(yù)作用，目前尚未見報(bào)道。本研究采用大鼠右側(cè)海馬注射Aβ1-40建立AD大鼠模型，并用TEN進(jìn)行干預(yù)治療，觀察TEN對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白磷酸化水平的影響。

材 料 和 方 法

1材料

1.1藥物 TEN由本室自制，含TEN甲素、TEN乙素等成分，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，其中TEN甲素含量為72%。

1.2動(dòng)物 SD大鼠，體重(280±30) g，雌雄兼用，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為皖醫(yī)動(dòng)準(zhǔn)字01號(hào)。

1.3試劑 Aβ1-40購(gòu)自Sigma。臨用前以無菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成1 g/L，37 ℃孵育l周，并小心攪拌，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ[4]。兔抗β-actin、兔抗PKA多克隆抗體、鼠抗PP2A多克隆抗體、兔抗tau蛋白多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗p-tau(Ser396)為南京金斯瑞生物科技有限公司產(chǎn)品；生物素標(biāo)記羊抗鼠IgG為江蘇碧云天生物公司產(chǎn)品；生物素標(biāo)記羊抗兔IgG、正常山羊血清和SABC免疫組化試劑盒均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；HRP-DAB底物顯色試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑均為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.4儀器 江灣I型C腦立體定位儀，第二軍醫(yī)大學(xué)產(chǎn)品；2315型石蠟切片機(jī)，Leica產(chǎn)品；Olympus BX41熒光顯微鏡(帶DP70攝像系統(tǒng))，Olympus產(chǎn)品；5417型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，Eppendorf產(chǎn)品；DYCZ-24DN型，迷你雙垂直電泳儀(槽) 、DYCZ-40D型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽，均為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。

2方法

2.1動(dòng)物模型制作與實(shí)驗(yàn)分組 取SD大鼠50只，隨機(jī)分為：(1)對(duì)照組；(2)Aβ1-40組；(3)～(5)組為TEN低、中、高3個(gè)劑量組，每組10只。按前文報(bào)道的方法[3]行腦定位右側(cè)海馬CA1區(qū)注射(位置：前囟后3.0 mm，中線旁開2.0 mm，深度2.9 mm)。(2)～(5)組大鼠一次性注射Aβ1-40，每鼠1 μL，(1)組大鼠同部位注射等量無菌生理鹽水。術(shù)后給予青霉素鈉鹽4×104U肌注，每天1次，連續(xù)3 d。術(shù)后第4 d起，(3)～(5)組大鼠分別灌胃 TEN 18.5 mg/kg、37.0 mg/kg及74.0 mg/kg，(1)和(2)組大鼠灌胃等體積生理鹽水。連續(xù)用藥30 d。

2.2取材及樣本制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪開胸腔暴露心臟，灌注針從左心室插入致主動(dòng)脈根底，用手術(shù)剪剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水沖洗致流出液體無血水，再灌注4%多聚甲醛，待肝臟變成灰白色停止灌注，斷頭取腦，PBS清洗后，用10%中性甲醛固定，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、進(jìn)行冠狀切片，片厚4 μm。取0.2 g腦組織加1 mL蛋白裂解液，研磨裂解20 min(以上過程均在冰浴中完成)，低溫(0 ℃)高速(14 000 r·min-1)離心10 min，取上清置-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，用1% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶20 min，PBS洗3次每次5 min，用0.01 mol·L-1枸櫞酸鹽緩沖液沸水煮10 min，PBS洗3次每次5 min，5%新鮮山羊血清封閉37 ℃孵育30 min(勿洗，甩干即可)，加Ⅰ抗[總tau、p-tau(Ser396)、PKA和PP2A，PBS按1∶100稀釋]，濕盒內(nèi)孵化4 ℃過夜，滴加生物素標(biāo)記的Ⅱ抗應(yīng)用液(1∶100)，37 ℃孵育2 h，滴加2滴SABC 37 ℃孵育45 min，0.02% PBST溶液浸洗防非特異性背景，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封固。設(shè)立0.01 mol·L-1PBS代替Ⅰ抗作陰性對(duì)照。每個(gè)樣本隨機(jī)抽取1張腦片，在光鏡下隨機(jī)選取海馬CA1區(qū)1個(gè)視野(×400)，數(shù)200個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。

2.4Western blotting檢測(cè) 提取的蛋白樣品用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取適量樣品，加入等體積的2×上樣緩沖液(1 mol·L-1pH 6.8 Tris-HCl，2.5 mL；β-巰基乙醇，1.0 mL；SDS，0.6 g；甘油，2.0 mL；0.1%溴酚藍(lán)水溶液，1.0 mL；超純水，3.5 mL)混勻，在100 ℃沸水中煮5 min，各組取15 μg樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠、12%分離膠)電泳分離，先用100 V電泳待溴酚藍(lán)至濃縮膠底改用120 V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)距離分離膠底1 cm時(shí)停止電泳。分離的蛋白在250 mA、冰浴條件下轉(zhuǎn)膜150 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用TBST簡(jiǎn)單洗膜，室溫下用新配的5%脫脂奶粉封閉作用3 h，TBST簡(jiǎn)單洗膜后加入TBST稀釋的Ⅰ抗[β-actin(1∶1 000) 、總tau(1∶500)、p-tau(Ser396)(1∶700)、PKA(1∶500)和PP2A(1∶500)]4 ℃過夜；TBST洗滌3×20 min，加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，TBST洗滌2×20 min，TBS洗滌15 min，用化學(xué)發(fā)光劑避光反應(yīng)2～3 min，將NC膜置于保鮮膜包裹好后置于片夾中，在暗室中感光在膠片上。以β-actin作為內(nèi)參照，統(tǒng)計(jì)各組蛋白與β-actin灰度值的比值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1TEN對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)元總tau及p-tau(Ser396)表達(dá)的影響

采用免疫組化法分別檢測(cè)神經(jīng)元總tau及p-tau(Ser396)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中有極少量的tau及p-tau(Ser396)棕黃色斑塊出現(xiàn)，大多數(shù)神經(jīng)元形態(tài)完整，軸突結(jié)構(gòu)明顯，而Aβ1-40組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中tau及p-tau(Ser396)陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，尤以海馬CA1區(qū)最甚，與對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.01)；當(dāng)連續(xù)用藥30 d后，TEN 3個(gè)劑量組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中tau及p-tau(Ser396)陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，以高劑量組效果最佳(均P<0.01)。蛋白免疫印記檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)，Aβ1-40組大鼠神經(jīng)元中總tau和p-tau(Ser396)蛋白表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.01)，而經(jīng)TEN干預(yù)治療后，3個(gè)劑量組總tau和p-tau(Ser396)蛋白表達(dá)下調(diào)明顯(均P<0.01)，提示TEN對(duì)總tau蛋白和tau磷酸化有一定的抑制作用，見圖1～3。

Figure 1. Effect of TEN on the expression of total tau protein in CA1 region neurons of the hippocampus of AD rats(×400).A: sham operation group；B: Aβ1-40group；C: Aβ1-40+TEN(18.5 mg·kg-1) group；D: Aβ1-40+TEN(37.0 mg·kg-1) group；E: Aβ1-40+TEN(74.0 mg·kg-1) group.

圖1TEN對(duì)AD大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元總tau蛋白表達(dá)的影響

2TEN對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)元PKA和PP2A表達(dá)的影響

免疫組化顯示，對(duì)照組大鼠皮層和海馬中的PKA陽性細(xì)胞分布較少，而PP2A陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多，而Aβ1-40組大鼠皮層和海馬區(qū)神經(jīng)元中可見到大量的棕黃色斑塊的PKA陽性細(xì)胞，而PP2A陽性細(xì)胞數(shù)卻明顯減少，說明腦內(nèi)注射Aβ1-40可引起PKA活性增高和PP2A活性降低。當(dāng)連續(xù)對(duì)AD大鼠灌胃給予TEN 30 d后，發(fā)現(xiàn)TEN 3個(gè)劑量治療組均可以減低PKA的活性，增強(qiáng)PP2A的活性，與Aβ1-40組比較，差異顯著(均P<0.01)。蛋白免疫印跡檢測(cè)顯示，Aβ1-40組大鼠神經(jīng)元中PKA表達(dá)量上調(diào)(P<0.01)；而PP2A表達(dá)量下調(diào)(P<0.01)。經(jīng)TEN干預(yù)治療后，TEN治療組PKA表達(dá)量較模型組明顯降低，而PP2A表達(dá)量較模型組顯著升高，3個(gè)劑量組呈明顯的量效關(guān)系(均P<0.01)，圖2、4。

討 論

Tau蛋白是微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)中含量最高的組分。在正常人大腦中，tau蛋白處于一種低水平的磷酸化狀態(tài)(含2～3個(gè)磷酸基)，但在AD患者大腦中tau蛋白出現(xiàn)多位點(diǎn)的異常磷酸化，異常磷酸化的tau蛋白自身聚集成PHF/NFT結(jié)構(gòu)，最終誘發(fā)神經(jīng)元微管結(jié)構(gòu)廣泛破壞，正常軸突轉(zhuǎn)運(yùn)受損，引起突觸丟失神經(jīng)元功能損傷，發(fā)生腦神經(jīng)退行性病變[7-8]。目前，在PHF-tau中已鑒定出45個(gè)磷酸化位點(diǎn)[9]，尤其是Ser396、Ser404、Ser199/202、Thr231和Thr181位點(diǎn)的磷酸化，可以改變tau蛋白與微管結(jié)合部位的構(gòu)象，導(dǎo)致微管解體，細(xì)胞骨架破壞[10-11]。研究表明，Aβ的產(chǎn)生和在大腦皮層的沉積是AD形成和發(fā)展的重要因素[12]，大鼠腦內(nèi)注射凝集態(tài)Aβ可導(dǎo)致tau蛋白特定位點(diǎn)磷酸化水平升高和神經(jīng)元凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠右側(cè)海馬CA1區(qū)注射Aβ1-40建立AD模型，并應(yīng)用免疫組化和蛋白免疫印跡術(shù)觀察總tau及tau蛋白磷酸化變化水平，發(fā)現(xiàn)Aβ1-40可導(dǎo)致大鼠腦神經(jīng)元總tau蛋白及p-tau(Ser396)的表達(dá)上升，而連續(xù)口服TEN 30 d后，各治療組總tau蛋白及tauSer396位點(diǎn)磷酸化水平呈現(xiàn)不同程度的降低，其中以高劑量組效果最為明顯，揭示TEN能降低AD大鼠腦細(xì)胞中總tau蛋白含量和tau蛋白磷酸化水平，恢復(fù)tau蛋白的正常生理功能，有助于微管的組裝與穩(wěn)定性，防止NFT的形成。

圖2TEN對(duì)AD大鼠神經(jīng)元PKA、PP2A、總tau蛋白和p-tau(Ser396)表達(dá)的影響

圖3TEN對(duì)AD大鼠神經(jīng)元總tau蛋白和p-tau(Ser396)表達(dá)量的影響

圖4TEN對(duì)AD大鼠神經(jīng)元PKA和PP2A表達(dá)量的影響

細(xì)胞內(nèi)tau蛋白磷酸化水平主要受蛋白激酶(如PKA、GSK-3β等)和蛋白磷酸酶(如PP2A、PP2B等)的調(diào)節(jié)，正常情況下tau蛋白磷酸化與去磷酸化處于動(dòng)態(tài)平衡。但在AD時(shí)這種動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞而引起tau蛋白磷酸化異常增高。PKA是催化tau蛋白磷酸化最重要的蛋白激酶之一，它不僅自身直接催化tau蛋白多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，而且其對(duì)tau蛋白的預(yù)磷酸化使tau蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變更易被GSK-3β、CDK5等蛋白激酶磷酸化[13]。PP2A是神經(jīng)細(xì)胞中活性最強(qiáng)的磷酸酶，它能催化異常磷酸化tau蛋白去磷酸化(脫磷酸基)、釋放游離tau蛋白、恢復(fù)tau蛋白生物學(xué)活性以及松解NFT纏繞結(jié)構(gòu)[14-15]。用PP1和PP2A的抑制劑可引起大鼠海馬神經(jīng)元突觸和樹突丟失，伴有tau蛋白的過度磷酸化[16]。另外在PP2A基因突變小鼠腦中發(fā)現(xiàn)tau蛋白異常過度磷酸化現(xiàn)象[17]。研究證明，AD患者腦中PP2A和PP2B活性均低于正常老人。目前認(rèn)為AD患者大腦神經(jīng)細(xì)胞中蛋白激酶活性增高和磷酸酶活性缺陷可能是引起tau蛋白過度磷酸化的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠腦內(nèi)注射Aβ1-40可導(dǎo)致PKA表達(dá)含量升高及PP2A的活性受到抑制，經(jīng)TEN干預(yù)治療后，PKA表達(dá)含量明顯降低，同時(shí)PP2A的活性恢復(fù)。

綜上所述，TEN對(duì)AD大鼠腦神經(jīng)元的保護(hù)作用可能是通過下調(diào)PKA蛋白和上調(diào)PP-2A蛋白表達(dá)，從而降低腦神經(jīng)元總tau蛋白含量，恢復(fù)tau蛋白正常磷酸化，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)腦神經(jīng)元的作用。關(guān)于TEN治療AD是否還有其它途徑，尚待進(jìn)一步研究。

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EffectoftenuigeninontauproteinphosphorylationatSer396siteinneuronsofADratsinducedbyAβ1-40

XU Ke-le, CHEN Qin, LIU Wei, YAO Yuan-yuan, XIA Xing-xing, ZHANG Bei-lei, LI Yan-fei

(SchoolofLifeScience,AnhuiUniversity,AnhuiProvinceKeyLaboratoryofR&DofChineseMedicine,Hefei230039,China.E-mail:chenqin169@163.com)

AIM: To investigate the effect of tenuigenin (TEN) on hyperphosphorylation of tau protein in neurons of amyloid β-peptide1-40(Aβ1-40) -induced Alzheimer disease (AD) rats.METHODSAβ1-40was injected into hippocampus CA1 region of the rats to establish AD model. TEN at different doses (18.5 mg/kg, 37.0 mg/kg and 74.0 mg/kg) was intragastrically administered. The protein expression of protein kinase A (PKA),protein phosphatase 2A (PP2A), total tau and p-tau (Ser396) in the neurons was observed by the method of immunohistochemistry. The protein content of total tau and p-tau (Ser396), and the expression level of PKA and PP-2A were detected by Western blotting analysis.RESULTSIn Aβ1-40group, the level of total tau, the phosphorylation of tau protein and the expression of PKA were significantly increased compared with those in sham operation group. Meanwhile, the expression of PP2A in Aβ1-40group was lower than that in sham operation group. In TEN treatment group, the level of total tau, the phosphorylation of tau protein and the expression of PKA were markedly decreased, and the expression of PP2A was increased as compared with Aβ1-40group.CONCLUSIONTEN may protect the neurons from the toxic effect of Aβ1-40and reduce the hyperphosphorylation of tau (Ser396) in the neurons of AD rats by activating the expression of PP2A and inhibiting the expression of PKA.

Tenuigenin; Amyloid β-peptide; Alzheimer disease; Rats; Tau protein; Phosphorylation

R966

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.012