高賽男 李森 張林娜 孫躍 張福琴

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.北京四環(huán)科寶制藥有限公司，北京100071

高速逆流色譜法分離純化丁公藤中東莨菪內(nèi)酯

高賽男1李森1張林娜1孫躍2張福琴2

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.北京四環(huán)科寶制藥有限公司，北京100071

目的探討高速逆流色譜法（HSCCC）分離丁公藤中東莨菪內(nèi)酯的可行性及工藝。方法用純甲醇超聲萃取三次，得到丁公藤粗提物，再用HSCCC技術(shù)分離得到高純度的東莨菪內(nèi)酯。結(jié)果正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑系統(tǒng)（體積比為3.0∶5.0∶3.5∶5.0）具有較好的分離效果；較佳工藝條件為：轉(zhuǎn)速850 r/min、流動(dòng)相流速2 mL/min和水浴溫度25℃。結(jié)論采用HSCCC技術(shù)分離得到的東莨菪內(nèi)酯樣品經(jīng)高效液相色譜法檢測，純度可達(dá)98.04%。

高速逆流色譜法；丁公藤；東莨菪內(nèi)酯；高效液相色譜法

丁公藤，是旋花科植物丁公藤（Erycibe obtusifolia Benth.）或光葉丁公藤（Erycibe schmidtii Craib）的干燥藤莖，全年均可采收，切段或片，曬干[1]，制成中藥飲片，具有解表發(fā)汗、抗炎、疏風(fēng)祛濕、舒筋活絡(luò)、消腫止痛等功效。丁公藤的化學(xué)成分主要有東莨菪內(nèi)酯、東莨菪苷、咖啡酸和氯原酸等[2-3]，其中東茛菪內(nèi)酯具有祛風(fēng)、抗炎、止痛、抗真菌和抗腫瘤作用[4]，因此建立東莨菪內(nèi)酯的分離提純方法具有重要意義。

高速逆流色譜（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）是近年來發(fā)展起來的新型、不使用固態(tài)支撐體或載體的連續(xù)液-液分配色譜技術(shù)，具有分離速度快、樣品吸附低、分離重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，已被廣泛應(yīng)用于天然藥物成分的分析鑒定及分離制備。東莨菪內(nèi)酯為香豆素類化合物，目前香豆素的傳統(tǒng)分離多采用柱色譜和薄層色譜法，操作繁瑣，本實(shí)驗(yàn)采用半制備型高速逆流色譜儀從丁公藤粗提物中成功分離純化出東莨菪內(nèi)酯，經(jīng)高效液相色譜峰面積歸一化法分析，純度達(dá)到98.04%，為香豆素類化合物的高效、方便和快速分離提供了有效借鑒。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

TBE 300B高速逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)有限公司），AKTA prime泵及檢測系統(tǒng)（美國通用電器醫(yī)療集團(tuán)），LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），HH-1型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省榮華儀器制造有限公司），9312A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），DFT-100J型手提式高速中藥粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司），C3860型超聲波清洗器（河南省鞏義市英峪予華公司），Milli-Q Academic超純水器（法國密理博有限公司）。

1.2 試劑

東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110768-200504），粗提物的制備及高速逆流所用的有機(jī)溶劑正己烷、乙酸乙酯和甲醇均為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），HPLC分析用甲醇為色譜純（美國Fisher公司），實(shí)驗(yàn)室用水是自制的超純水。

丁公藤購自安徽省亳州市藥材總公司，經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)院申志英副教授鑒定確認(rèn)為光葉丁公藤的干燥藤莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

稱取丁公藤粉末（過40目篩）300 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇500 mL，放置過夜。超聲30 min，過濾，濾渣再分別用500 mL的甲醇超聲過濾兩次，合并濾液，濾液經(jīng)減壓濃縮后轉(zhuǎn)移到真空干燥器中干燥，最后得到丁公藤干浸膏5.40 g，稱取適量的干浸膏用甲醇溶解并定容，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

準(zhǔn)確稱取一定量的東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品，置5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，超聲10 min，冷卻后補(bǔ)足體積，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.3 高速逆流溶劑系統(tǒng)的選擇

對(duì)樣品進(jìn)行分離的必要條件是在互不相溶的兩相中具有合適的分配系數(shù)，分配系數(shù)值過小，待分離物來不及分離，就隨著流動(dòng)相流了出來；但是分配系數(shù)值太大的話，分離時(shí)間過長，浪費(fèi)試劑，理想的分配系數(shù)值應(yīng)在0.5～1.5之間。按照所需比例，配制20 mL的溶劑，置于分液漏斗中靜置過夜。稱取待測樣品適量放入5 mL的試管中，吸取上、下相溶劑各2 mL，充分振搖，靜置分層，分別取上、下相液體用HPLC檢測東莨菪內(nèi)酯的峰面積，設(shè)上、下相峰面積分別為A1和A2，根據(jù)公式K=A1/A2，求出分配系數(shù)值。根據(jù)丁莨菪內(nèi)酯的極性，重點(diǎn)考察了HSCCC中常用于中等極性物質(zhì)分離的溶劑體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，研究了不同溶劑配比對(duì)目標(biāo)組分東莨菪內(nèi)酯分配系數(shù)K值的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著體系中甲醇/水比例的增加，分配系數(shù)K值出現(xiàn)下降的趨勢。當(dāng)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的體積配比調(diào)為3.0∶5.0∶3.5∶5.0和3.0∶5.0∶3.0∶5.0時(shí)，K值分別為0.60和1.28，滿足理想的K值范圍，可以進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.4 高速逆流色譜分離效果考察

用分液漏斗分別配制2 000 mL體積比為3.0∶5.0∶3.5∶5.0和3.0∶5.0∶3.0∶5.0的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的兩種溶劑系統(tǒng)，密封振蕩混合后靜置分層過夜，分出上相（固定相）和下相（流動(dòng)相），超聲脫氣30 min。打開循環(huán)水浴，預(yù)熱高速逆流色譜系統(tǒng)，待水浴溫度達(dá)到設(shè)置溫度25℃后，打開泵，將固定相以30 mL/min的流速泵入分離柱，等有液體流出后按泵暫停鍵；開啟主機(jī)轉(zhuǎn)速控制器，使高速逆流色譜儀螺旋管柱按順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到850 r/min后，再以2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相。用量筒收集柱后流出物，首先從溢出口流出的是固定相，待有流動(dòng)相流出時(shí)，按泵暫停鍵，讀出流出的固定相體積Vs。根據(jù)保留在分離柱內(nèi)的固定相體積占分離柱總?cè)莘eVt的比例就可求出固定相的保留率R，即：R=

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體積比為3.0∶5.0∶3.5∶5.0和3.0∶5.0∶3.0∶5.0的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的兩種溶劑系統(tǒng)，對(duì)應(yīng)的固定相保留率均在0.7左右，兩種溶劑系統(tǒng)似乎不存在什么差別。但是把供試液注入進(jìn)樣環(huán)后，以2 mL/min的流速對(duì)丁公藤粗提液進(jìn)行分離，卻可從兩者的分離效果圖中看出它們的差別。

從圖1可以看出，當(dāng)正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水的體積配比3.0∶5.0∶3.5∶5.0時(shí)，180 min內(nèi)，主要有兩個(gè)峰出現(xiàn)，峰形尖銳，分離效果良好；但是當(dāng)體積配比為3.0∶5.0∶3.0∶5.0時(shí)，對(duì)應(yīng)兩個(gè)組分的峰形很鈍，分離效果不好，因此采用體積配比為3.0∶5.0∶3.5∶5.0的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水體系，并用試管分別收集在123～140 min和142～163 min兩個(gè)時(shí)間段所對(duì)應(yīng)峰的流出物，記為收集液a和收集液b，備用。

2.5 高效液相色譜分析

2.5.1 高效液相色譜條件色譜柱是日本島津公司的Inertsil ODS-SP（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測波長是347 nm，流動(dòng)相由甲醇和水（30∶70，V/V）構(gòu)成，總流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

2.5.2 高效液相色譜用供試液的制備將收集得到的a、b兩個(gè)流分分別蒸干，用甲醇溶解，0.45 μm的微孔濾膜過濾后定容，得到純化后的供試品溶液，備用。

2.5.3 分離樣品的測定參照“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件，分別對(duì)東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品、a和b三種溶液進(jìn)行圖譜分析，發(fā)現(xiàn)丁公藤粗提液在正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3.0∶5.0∶3.5∶5.0）溶劑體系下，溶液b的保留時(shí)間與東莨菪內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品的一致，因此判斷收集液b為東莨菪內(nèi)酯，純度高達(dá)98.04%。

3 討論

考察了不同溶劑（甲醇、乙醇和70%乙醇）和不同提取方法（超聲和加熱回流）對(duì)東莨菪內(nèi)酯含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用甲醇超聲提取時(shí)，操作簡單，得到的東莨菪內(nèi)酯含量最高。而在選擇高速逆流色譜溶劑系統(tǒng)時(shí)，考查了不同體積配比的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水溶劑體系，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，當(dāng)四種溶劑的體積比為3.0∶5.0∶3.5∶5.0時(shí)，丁公藤粗提液的分離效果最好，分離出來的東莨菪內(nèi)酯純度達(dá)到98.04%，此方法可為以后分離各類酯類化合物提供有益借鑒。

[1]國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：1.

[2]譚建寧，張贊贅.不同來源丁公藤藥材中東莨菪內(nèi)酯含量的研究[J].中成藥，2008，30（11）：1651-1653.

[3]陳玉敏，曹紅，周蘇萍，等.高效液相色譜法測定丁公藤中東莨菪內(nèi)酯的含量[J].中成藥，2005，27（12）：1461-1462.

[4]孫文基.天然活性成分簡明手冊(cè)[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998：507.

[5]韓忠明，王云賀，韓梅，等.高速逆流色譜分離純化防風(fēng)中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷[J].分析化學(xué)，2009，37（11）：1679-1682.

[6]張?zhí)煊?逆流色譜技術(shù)[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2001：171.

Isolation and purification of scopoletin from Erycibe obtusifolia by highspeed counter-current chromatography

GAO Sainan1LI Sen1ZHANG Linna1SUN Yue2ZHANG Fuqin2
1.College of Pharmacy,Daqing Campus of Harbin Medical University,Heilongjiang Province,Daqing163319,China; 2.Sihuankebao Pharmaceuticals Co.Ltd.,Beijing100070,China

Objective To study the feasibility and techniques for isolating scopoletin from Erycibe obtusifolia by highspeed counter-current chromatography(HSCCC).Methods Erycibe obtusifolia was ultrasonically extracted in 100% methanol three times,and then a HSCCC unit was used to get high purity of scopoletin.Results The preferable solvent system was composed of hexane-ethyl acetate-methanol-water(3.0∶50∶3.5∶5.0,V/V),and the preferable technical conditions were as followed:the rotate speed was 850 r/min,the mobile phase flow rate was 2 mL/min,and the bath temperature was 25℃.Conclusion The purity of scopoletin sample isolated by HSCCC is 98.04%through the technique of high performance liquid chromatography(HPLC).

HSCCC;Erycibe obtusifolia;Scopoletin;HPLC

R284.2

A

1673-7210（2012）09（b）-0122-03

2012-05-03本文編輯：衛(wèi)軻）

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：11551178）。[作者簡介]高賽男（1975-），女，湖南永順人，土家族，碩士研究生，講師，主要從事天然藥物活性成分高效分離。