姜 北，張 杰，周 濃，艾德華J.肯耐利

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.紐約市立大學(xué)萊曼學(xué)院生命科學(xué)系，美國(guó)紐約NY10468）

炙升麻與幾種升麻屬植物抗氧化活性研究

姜 北1，張 杰1，周 濃1，艾德華J.肯耐利2

（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000；2.紐約市立大學(xué)萊曼學(xué)院生命科學(xué)系，美國(guó)紐約NY10468）

目的：了解常見升麻屬植物抗氧化活性，探討中藥材升麻炮制過程中酚酸類成分與抗氧化活性的變化。方法：采用DPPH法與HPLC法對(duì)8種亞洲、北美洲升麻屬植物共計(jì)26個(gè)樣品進(jìn)行抗氧化活性與酚酸類成分分析，以了解氧化活性與酚酸類成分之間的關(guān)系。結(jié)果：絕大部分樣品IC50>150 μg·mL-1；炙升麻在炮制過程中酚酸類成分會(huì)發(fā)生變化，且工藝流程對(duì)結(jié)果影響很大，抗氧化活性也會(huì)受到進(jìn)一步影響。結(jié)論：升麻屬植物樣品總體上抗氧化活性不高；中藥材升麻植物來源具有多樣性，不同的樣品間在抗氧化活性方面存在較大差異；炙升麻在炮制過程中酚酸類成分會(huì)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其抗氧化活性與原植物相比發(fā)生較大變化，是否影響升麻的藥性與藥效值得進(jìn)一步研究。

升麻屬植物；炙升麻；抗氧化活性；DPPH；酚酸類成分

升麻（Actaea cimicifuga或Cimicifuga foetida）為毛茛科升麻屬植物，為一常見市售中藥；藥用根莖，具有清熱解毒、升舉陽氣、發(fā)表透疹的功效，主治風(fēng)熱頭痛、齒痛、口瘡、咽喉痛、子宮脫垂等癥〔1〕。目前市面上銷售的升麻藥材主要有生升麻與炙升麻兩種，炙升麻又可分為蜜制、酒制以及升麻炭等〔2〕。據(jù)中國(guó)藥典，中藥升麻可以來源于三種近緣植物：升麻（A.cimicifuga）、興安升麻（A.dahurica）、大三葉升麻（A.heracleifolia）〔1〕。升麻屬共有28種植物，主要分布在亞洲與北美洲〔3-4〕。除上述三種升麻屬植物外，在中國(guó)較為常見的種類還有野升麻（單穗升麻，A.simplex）、小升麻（A.acerina）等；在北美洲分布有8個(gè)種，常見的有A.cordifolia；A.pachypoda；A. rubra；A.racemosa（總狀升麻），其中總狀升麻（也叫black cohosh）分布、使用最為廣泛，研究報(bào)道很多，近年來已成為美國(guó)十大暢銷植物藥〔5〕。

升麻屬植物主要含有三萜苷類、酚酸類等化學(xué)成分〔6〕，其中部分植物酚酸類成分含量高達(dá)3%左右〔7〕，因此，酚酸類化合物是該屬植物的重要活性成分〔8〕。由于酚酸類成分多具有良好的抗氧化作用〔9-10〕，因此，本研究采用DPPH法，對(duì)8種常見的升麻屬植物以及中藥材炙升麻的抗氧化活性、主要酚酸類成分含量等進(jìn)行了研究，以了解該屬植物抗氧化活性基本情況以及炮制過程對(duì)于酚酸類化合物與抗氧化活性的影響，為合理利用升麻屬植物提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)品：咖啡酸（caffeic acid，1）與阿魏酸（ferulic acid，2）（Sigma Chemical Co.，St. Louis，USA）；蜂斗菜酸（fukinolic acid，3，純度95.90%）與升麻酸A（cimicifugic acidA，4，純度96.95%）由black cohosh分離得到〔7〕。甲醇（天津市化學(xué)試劑三廠，批號(hào)050412），95%乙醇（天津市風(fēng)船試劑科技有限公司，批號(hào)080114），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Aldrich Chem Co，USA），甲酸（上海市三浦化工有限公司），乙腈（HPLC專用，F(xiàn)isher Scientific，USA），二甲亞砜（DMSO，金山化工滬Q/ HG22-589-97），蜂蜜（云南省云龍縣云蜂蜂業(yè)，生產(chǎn)日期2007/12）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（BIO-TEX，PowerwaveXS），高效液相色譜儀（Agilent 1100）附帶G1315A/B DAD檢測(cè)器，遠(yuǎn)紅外循環(huán)式烘箱（SWY-3），電子天平（Mettler Toledo AL204），隔水式恒溫培養(yǎng)箱，微量加樣器（Eppendorf Research）。

1.3 植物樣品 升麻（A.cimicifuga）（SHM-1、SHM-2）分別由云南大理蒼山東、西坡采集得到，由大理學(xué)院藥學(xué)院馬曉匡教授鑒定，樣品SHM-1r系SHM-1的須根部分；升麻樣品SHM-3～5由大理市三家中藥店購(gòu)得；樣品A.simplex（SIM-1）、A.mairei（MAI-1）采自云南昆明地區(qū)，為人工種植品種；A. cordifolia（COR-1）、A.pachypoda（PYD-1）、A.rubra（RUB-1）、A.arizonica（ARI-1）、A.racemosa（RAC-1）分別采自美國(guó)紐約地區(qū)及西部地區(qū)，由紐約植物園Timothy J.Motley博士鑒定；商品炙升麻樣品（ZSHM-1～9）由大理市多家中藥店購(gòu)得，制作方法不明；樣品（SHM-2-Z1～3）為自制炙升麻。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 炙升麻樣品的制備 取升麻（SHM-2）切片50 g置入蒸發(fā)皿中翻炒至樣品外部呈焦黑色，內(nèi)部黃褐色，無煙后取出得炙升麻樣品SHM-2-Z1；炙升麻樣品SHM-2-Z2由生升麻SHM-2（50 g）加蜂蜜（12.5 g）文火翻炒至不沾手后制得；樣品SHM-2-Z3則由生升麻SHM-2（50 g）加蜂蜜（12.5 g）于100℃下恒溫烘烤至干而成。

2.2 樣品提取 分別稱取樣品10 g，粉碎后用100 mL 80%甲醇室溫下浸取，共4次，每次時(shí)間為24 h；合并提取液，在45℃下濃縮至干，稱重，計(jì)算提取率。

2.3 DPPH實(shí)驗(yàn) 精確稱量樣品提取物10 mg左右，溶解在2 mL DMSO中，之后用DMSO按1∶3、1∶1、1∶1、1∶1的比例稀釋。以DMSO、維生素C分別作為對(duì)照，在96孔板上用50 μL供試品與150 μL DPPH（400 mmol μL-1）液混合，放入37℃的恒溫培養(yǎng)箱中30 min，之后用酶標(biāo)儀于515 nm處測(cè)定OD值；數(shù)據(jù)按以下公式處理得到抑制率（%In），最后計(jì)算出供試品的IC50數(shù)值（C空白的吸收值，S凈吸收值）：

2.4 HPLC分析 樣品8～10 mg用2 mL 70%甲醇超聲溶解，0.45 μm濾膜過濾。ALTEX Ultrasphere-ODS（4.6×250 mm，5 μm）分析柱，乙腈（A）/5%甲酸水溶液（B）為洗脫劑，洗脫條件為0～15 min將A由5%增至15%，保持5 min后在20～50 min由15%增至50%，50～55 min增至100%；流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。該分析方法的穩(wěn)定性與可靠性等已在我們以前的研究中予以報(bào)道〔11〕。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 樣品的抗氧化活性 各樣品抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。根據(jù)DPPH試驗(yàn)評(píng)判原則，當(dāng)樣品的IC50＞150 μg·mL-1時(shí)抗氧化活性微弱，當(dāng)樣品的IC50＞200 μg·mL-1時(shí)則無抗氧化活性，因此，本研究中絕大部分供試樣品無顯著抗氧化活性，僅有第20、24號(hào)樣品具有較好的抗氧化活性；而第2、11、19、23號(hào)樣品有一定的抗氧化活性。

3.2 高效液相色譜分析 實(shí)驗(yàn)中選擇了部分炙升麻樣品進(jìn)行了HPLC分析，結(jié)果見表2。自制炙升麻樣品的HPLC分析結(jié)果如圖1所示。根據(jù)紫外譜圖特征（圖2），樣品中所含酚性成分類型可以分成兩類：酚酸類衍生物（化合物1～4）與色原酮類化合物（化合物a與b）。由于許多酚酸類衍生物為升麻屬植物特有，因此，實(shí)驗(yàn)中我們選擇了4個(gè)此類成分作定量研究（表2），其余樣品的酚酸類成分含量狀況在我們之前進(jìn)行的研究中已有報(bào)道〔7，12〕。

表1 樣品抗氧化活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 生升麻（SHM-2）與炙升麻（SHM-2-Z1～3）HPLC譜圖（320 nm）

從圖1可知，生升麻（SHM-2）經(jīng)高溫加工處理成炙升麻（SHM-2-Z1與SHM-2-Z2）后，其成分有較大改變，化合物3與4有明顯分解，同時(shí)在4～10 min處有新成分出現(xiàn)，說明溫度對(duì)升麻屬植物酚酸類成分有較大影響。與此同時(shí)，炙升麻（SHM-2-Z3）與生升麻（SHM-2）相比酚酸類成分構(gòu)成相似，顯示較低溫度下（100℃）加工樣品時(shí)其酚酸類成分可基本保持穩(wěn)定，表2中的有關(guān)數(shù)據(jù)可進(jìn)一步證實(shí)這一論點(diǎn)。

表2 部分樣品主要酚酸類成分含量

圖2 酚酸類衍生物（A）與色原酮（B）的紫外譜圖

4 討論

升麻屬植物均含有酚酸類成分，但提取物抗氧化活性總體偏弱，僅有升麻樣品SHM-1r與美洲升麻屬植物Actaea rubra（RUB-1）顯示出一定程度的抗氧化活性（見表1），后者與已發(fā)表的研究結(jié)果基本吻合〔7〕。究其原因，除植物種類差異是重要原因外，還應(yīng)與根莖提取物中多糖類等非抗氧化成分比例較高有關(guān)。例如，同樣的植物樣品其根莖提取物（SHM-1）基本上無抗氧化活性（IC50=253 μg·mL-1），但根（即根莖周圍的須根）提取物（SHM-1r）卻顯示出一定的抗氧化活性（IC50=125 μg·mL-1），而后者的提取率較前者低很多。

另外，多數(shù)樣品的抗氧化活性不高，還可能與樣品加工、儲(chǔ)存不當(dāng)造成部分酚酸性成分被破壞有關(guān)。研究表明，升麻屬植物的主要酚酸性成分抗氧化活性很強(qiáng)，但不穩(wěn)定〔11〕。因此，在植物樣品加工、干燥、儲(chǔ)存過程中均可能導(dǎo)致其分解破壞而使抗氧化活性下降。潘瑞樂等人也曾對(duì)升麻炮制前后有效成分進(jìn)行了研究比較，升麻切制和蜜制以后，阿魏酸和異阿魏酸含量均有所增高，且蜜制片比切片含量增加更多。并認(rèn)為升麻酚酸類化合物多以酸酯的形式存在，可能在炮制過程中，其酸酯類成分水解生成有機(jī)酸和醇類，使阿魏酸和異阿魏酸含量增加〔13〕。我們的研究結(jié)果充分證實(shí)了這一結(jié)論，因?yàn)榧訜?、尤其是有水分存在的條件下蜂斗菜酸（3）、升麻酸A（4）與升麻酸B等成分很容易分解，產(chǎn)生咖啡酸（1）、阿魏酸（2）、異阿魏酸及其它一些成分〔11〕。

炙升麻樣品抗氧化活性普遍較生升麻為好，其中有四個(gè)還顯示出較強(qiáng)的抗氧化活性，這也許與添加成分有關(guān)。在模擬炙升麻的過程中我們發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)工藝在升麻炒制、蜜制時(shí)很難嚴(yán)格控制炮制溫度。由于溫度對(duì)于升麻植物中酚酸性成分的穩(wěn)定性影響很大，因此，炙升麻的產(chǎn)品質(zhì)量難以嚴(yán)格控制。當(dāng)我們將升麻炮制程序改為一定溫度、時(shí)間下烘制時(shí)，產(chǎn)品在化學(xué)成分方面基本保持了原植物特性，但是否符合傳統(tǒng)中醫(yī)、中藥用藥理論與規(guī)范，尚有待進(jìn)一步研究。由提取率來看，生升麻SHM-2的提取率為15.1%，而三個(gè)炙升麻樣品SHM-2-Z1～3的提取率分別為15.4、24.5、27.1%，顯然蜜炙升麻提取物中含有較多的外加成分，同時(shí)，100℃恒溫下烘制的蜜炙升麻比炒制的蜜炙升麻溫度要低一些，從而使酚酸性成分破壞較少。但由于添加成分含量高，造成了近乎一倍的稀釋效應(yīng)，因而抗氧化活性受到較大影響。

HPLC分析結(jié)果顯示市場(chǎng)上銷售中藥材升麻，不論是生升麻還是炙升麻，其酚酸性化學(xué)成分差異都很大，確切原因尚無法推知?？赡艿囊蛩匕óa(chǎn)地與收獲季節(jié)不同、植物品種差異、加工工藝不同等諸多因素，因此，在實(shí)際應(yīng)用過程中需密切注意由此可能導(dǎo)致的藥材品性方面存在的差異。

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典〔S〕.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：50.

〔2〕國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：下卷〔M〕.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：175.

〔3〕Compton JA，Culham A，Jury SL.Reclassification of Actaea to include Cimicifuga and Souliea（Ranunculaceae）：phylogeny inferred from morphology，nrDNA，ITS，and cpDNA trnL-F sequence variation〔J〕.Taxon，1998，47： 593.

〔4〕中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志：27卷〔M〕.北京：科學(xué)出版社，1979：94.

〔5〕Cavaliere C，Rea P，Lynch ME，et al.Herbal supplement sales experience slight increase in 2008〔J〕.HerbalGram，2009，82：58.

〔6〕林玉萍，秋明華，李忠榮，等.升麻屬植物的化學(xué)成分與生物活性研究〔J〕.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，6（14）：58.

〔7〕Nuntanakorn P，Jiang B，Yang H，et al.Analysis of polyphenolic compounds and radical scavenging activity of four American Actaea species〔J〕.Phytochem Anal，2007，18：219.

〔8〕Burdette JE，Chen SN，Lu ZZ，et al.Black cohosh（Cimicifuga racemosa L.）protects against menadioneinduced DNA damage through scavenging of reactive oxygen species：bioassay-directed isolation and characterization of active principles〔J〕.J Agric Food Chem，2002，50：7022.

〔9〕劉榮華，陳蘭英，朱根華，等.單子山楂葉中多元酚類成分及其抗氧化活性研究〔J〕.中草藥，2007，38（10）：1541.

〔10〕綦菁華，王有年，于同泉，等.不同品種桃的酚類活性成分及其抗氧化功能研究〔J〕.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，（1）：37.

〔11〕Jiang B，Lyles JT，Reynertson KA，et al.Stability evaluation of selected polyphenols and triterpene glycosides in black cohosh〔J〕.J Agric Food Chem，2008，56：9510.

〔12〕Jiang B，Ma CH，Motley T，et al.Phytochemical fingerprinting to thwart black cohosh adulteration：a 15 actaea species analysis〔J〕.Phytochem Anal，2011，22：339-351.

〔13〕潘瑞樂，陳迪華，斯建勇，等.升麻炮制前后有效成分的比較研究〔J〕.中成藥，2007，29（9）：1335-1337.

Antioxidative Activities of Actaea Plants and Processed Shengma

JIANG Bei1,ZHANG Jie1,ZHOU Nong1,KENNELLY Edward J.2
（1.College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.Department of Biological Science,Lehman College,City University of New York,NY 10468,USA）

Objective:To better understand the antioxidative activities of the processed Shengma (Zhi Shengma)as well as the common Actaea plants.Methods:Studies on 26 samples of eight Actaea species from both Asia and North America were performed by using DPPH assay and HPLC analysis.Results:Most of the Actaea samples showed weak/no antioxidative activity with IC50>150 μg·mL-1.Conclusion:The raw extracts of the roots and rhizomes of the Actaea plants only possessed low antioxidative activities. Actaea species is rich in polyphenols and the latter often show certain antioxidative activities.However,since the chemical profiles for polyphenols of Actaea samples are determined by many factors like plant sources,degree of drying,the way to prepare the processed Shengma,the quality and antioxidative activity of both Shengma and processed Shengma are often unstable.Great care should be taken when Shengma or processed Shengma are subjected for bioactive evaluations.

Actaea（Cimicifuga）plants;processed Shengma;antioxidation;DPPH;polyphenols

R285.61［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號(hào)］1672-2345（2012）03-0001-04

云南省中青年學(xué)術(shù)技術(shù)帶頭人后備人才基金資助項(xiàng)目（2008PY005）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目［2009］1001

2012-01-19

姜北，博士，教授，主要從事藥用植物與藥物資源研究.

（責(zé)任編輯 毛本勇）