余文新，莊滿賢，林 勵，*，鄧瑞云，彭麗詩，李麗月

(1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510120;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006)

正交設(shè)計優(yōu)選檀香葉總黃酮提取工藝

余文新1，莊滿賢2，林 勵2，*，鄧瑞云2，彭麗詩2，李麗月2

(1.廣東省中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東廣州510120;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510006)

以檀香葉為原料，在單因素實驗基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，以總黃酮含量為考察指標，采用正交實驗優(yōu)化最佳提取工藝。在實驗影響因素中，影響程度從大到小依次為乙醇濃度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時間。實驗結(jié)果表明:檀香葉總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度60%，提取時間20min，料液比1∶40，提取次數(shù)為1次。此工藝條件較為穩(wěn)定，檀香葉總黃酮可達3.24%。

檀香葉，總黃酮，正交設(shè)計，提取工藝

檀香葉 采自湛江南藥實驗場，經(jīng)林勵研究員鑒定為檀香科植物檀香(Santalum album L.)的葉子，干燥后粉碎備用，現(xiàn)保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗管理中心;蘆丁對照品 中國藥品與生物制品鑒定所提供，批號100080－200707;乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等 均為分析純試劑。

Agilent 8453E紫外可見分光光度計 P.R.China; DFY200－粉碎機 浙江溫嶺市大德中藥機械有限公司制造;PrecisaXS225A電子分析天平 d=0.0001g，Switzerland;KQ3200B超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司，功率500W，頻率40kHz。

1.2 實驗方法

1.2.1 檀香葉總黃酮含量測定

1.2.1.1 供試品溶液的制備 取檀香葉粉末約1g，精密稱定，置于50mL具塞錐形瓶中，加入60%乙醇40mL，超聲提取20min，冷卻至室溫后過濾至100mL量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，作為供試樣品溶液。

1.2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品15.42mg，置于50mL量瓶中，用50%乙醇定容至刻度，搖勻，得濃度為0.3084mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.1.3 測定波長的選擇 取適量供試品溶液和對照品溶液適量，置于25mL量瓶中，先加50g/L的亞硝酸鈉溶液1.0mL，搖勻后放置6min，再加入100g/L的硝酸鋁溶液1.0mL，搖勻后放置6min，加1.0mol/L氫氧化鈉溶液10mL，加50%乙醇定容到刻度，放置15min，即得。用紫外－可見分光光度計進行掃描，結(jié)果兩者均在500nm處有最大吸收，故選擇500nm作為測定波長。

1.2.1.4 線性關(guān)系考察 精密量取蘆丁對照品溶液1、2、3、4、5、6mL，分別置于25mL容量瓶中，依1.2.1.3項下“先加50g/L的亞硝酸鈉溶液1.0mL，…”操作，于500nm處測吸收度，以吸收度A為縱坐標、濃度C為橫坐標，得回歸方程為A=11.741C－0.006，r= 0.9999。結(jié)果表明:蘆丁對照品在濃度 0.0123～0.0740mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.1.5 精密度實驗 精密量取蘆丁對照品溶液適量，依 1.2.1.3項下“先加50g/L的亞硝酸鈉溶液1.0mL，…”操作，于500nm處連續(xù)6次測定吸光度，結(jié)果其吸光度的RSD為0.06%，表明精密度良好。

1.2.1.6 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批號供試品約1g，平行6份，按1.2.1.1項下供試品制備方法制備樣品，測定其含量。結(jié)果平均含量為3.2415%，RSD為0.84%，表明該方法的重復(fù)性較好。

1.2.1.7 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液適量，分別在顯色后0、15、30、45、60、90、120min時測定其吸光度，結(jié)果其吸光度的RSD為1.01%，表明供試品在120min內(nèi)是穩(wěn)定的。

1.2.1.8 加樣回收率實驗 取同一供試品約0.5g，平行6份，精密稱定，分別加入相應(yīng)量的蘆丁對照品，按1.2.1.1項下供試品制備方法制備樣品，測定其含量，計算回收率，結(jié)果其平均回收率為96.39%，RSD為0.97%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 1 The recovery of total flavonoids(n=6)

1.2.1.9 樣品的測定 取供試品溶液適量，分別置于25mL容量瓶中，依1.2.1.3項下“先加50g/L的亞硝酸鈉溶液1.0mL，…”操作，于500nm處測吸收度，代入公式計算:

其中，C為代入標準曲線計算得到的提取液總黃酮含量(mg/mL)，V1為測定用提取液體積(mL)，V2為樣品提取液總體積(mL)，M為樣品重量(g)。

1.2.2 檀香葉總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素考察 選取乙醇濃度、提取時間、料液比為考察因素，分別以其中一個因素為變量，固定其他因素，考察不同因素的不同水平對總黃酮含量的影響，選定不同因素的水平。

1.2.2.2 正交實驗 為尋求最佳工藝提取條件組合，在單因素考察的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取時間(D)四個因素為考察因素，每個因素選擇3個水平，以總黃酮含量為指標，采用了L9(34)正交實驗表安排實驗，并確立因素水平表，見表2。

表2 實驗因素水平表Table 2 Factors and levels of experimental

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察

2.1.1 乙醇濃度的考察 取檀香葉粉末5份，每份約1g，精密稱定，分別加入濃度為10%、30%、50%、70%、90%乙醇40mL，超聲30min，冷卻至室溫后過濾，用對應(yīng)濃度的乙醇定容至100mL，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，當乙醇濃度50%時，總黃酮含量最高。

圖1 乙醇濃度對總黃酮含量的影響Fig.1 The study of ethanol concentration

2.1.2 提取時間的考察 取檀香葉粉末6份，每份約1g，精密稱定，加入50%乙醇40mL，分別超聲提取15、30、45、60、75、90min，冷卻至室溫后過濾，保存濾液，用50%乙醇定容至100mL，測定總黃酮含量，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出提取時間為30min時，總黃酮含量最高。

2.1.3 料液比的考察 取檀香葉粉末，每份約1g，精密稱定，按料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50加入50%乙醇，超聲提取30min，濾過，濾液置于100mL容量瓶中，用50%乙醇定容置刻度，測定總黃酮含量結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，料液比為1∶50時，總黃酮含量最高。

2.2 正交實驗

正交實驗結(jié)果及方差分析見表3和表4。

由表3和表4可知，四個因素對總黃酮提取率的影響大小的次序為:乙醇濃度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時間，兩個表的結(jié)果一致。由表3的極差結(jié)果可知，總黃酮提取率最高的工藝應(yīng)為A3B2C2D3，即用60%乙醇提取，提取時間為30min，料液比為1∶50，提取次數(shù)為3次。但是由表4方差分析可知，乙醇濃度對提取率有顯著性影響，提取時間、料液比和次數(shù)對提取率沒有顯著性影響。從節(jié)約生產(chǎn)時間和適用于工業(yè)生產(chǎn)的角度，故而選擇工藝A3B1C1D1，即用60%乙醇提取，提取時間20min，料液比1∶40，提取次數(shù)1次。

圖2 提取時間對總黃酮含量的影響Fig.2 The study of extracting time

圖3 料液比對總黃酮含量的影響Fig.3 The study of the ratio of material and solvent

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

表4 方差分析Table 4 Results of variance analysis

2.3 驗證實驗

取樣品粉末平行三份，按A3B1C1D1的條件制備樣品，測定總黃酮含量，結(jié)果三份樣品的總黃酮含量平均值為3.24%，RSD為0.84%，與正交實驗中提取率最高的工藝A3B2C1D3的含量3.46%相比，提取率較為接近。表明該提取工藝穩(wěn)定、合理，方案可行。

3 結(jié)論與討論

3.1 本實驗考察了乙醇濃度、提取時間和料液比三個單因素對提總黃酮提取率的影響，而關(guān)于提取次數(shù)，多數(shù)文獻［4－7］均在正交實驗中設(shè)計為1、2、3次，因此不需要對提取次數(shù)進行單因素考察。

3.2 超聲波提取法近年來已經(jīng)越來越多的運用到中藥的提取中，相比于傳統(tǒng)的提取方法，具有速度快、提取效率高、簡便易行等優(yōu)點［8－9］。本文采用超聲技術(shù)提取檀香葉中總黃酮，研究結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為:用60%乙醇提取，提取時間20min，料液比1∶40，提取次數(shù)1次，在此提取條件下檀香葉總黃酮含量為3.24%，較為穩(wěn)定、合理，可行性較高，適合于檀香葉總黃酮的工業(yè)生產(chǎn)。

［1］顏仁梁，林勵.檀香的研究進展［J］.中藥新藥與臨床藥理，2003，14(3):218－220.

［2］顏仁梁，劉志剛，林勵.檀香化學(xué)成分研究進展［J］.中藥材，2006，29(4):337－338.

［3］文海濤，趙紅英，林勵，等.乙烯利刺激對檀香葉中總黃酮含量的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，27(2):156－158.

［4］馬俊鵬，韓海霞，郭喜紅，等.正交實驗優(yōu)選啤酒花總黃酮提取工藝［J］.中國藥房，2010，21(11):994－996.

［5］楊志芳，王維娜，楊坤，等.正交設(shè)計優(yōu)選羅布麻葉中總黃酮提取工藝［J］.中草藥，2006，37(8):1177－1178.

［6］馮衛(wèi)生，趙獻敏，王彥志，等.正交設(shè)計優(yōu)化卷柏葉中總黃酮提取工藝［J］.中草藥，2009，40(6):893－896.

［7］蘇志偉，田鶴，馬英麗，等.金蓮花中總黃酮提取工藝的研究［J］.中草藥，2007，38(6):850－851.

［8］趙佳，霍俊偉.藍果忍冬總黃酮提取工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(11):242－244.

［9］陳海光，黃敏，于立梅.青皮竹葉黃酮工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(9):245－247.

Optimization of the extraction technology of total flavonoids from leaves of Santalum album L.by orthogonal experiment

YU Wen－xin1，ZHUANG Man－xian2，LIN Li2，*，DENG Rui－yun2，PENG Li－shi2LI Li－yue2
(1.Department of Pharmacy，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510120，China; 2.Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China)

The extraction technology of total flavonoids from Leaves of Santalum album L.was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as index and with ethanol concentration，extracting time，the ratio of raw materials to solvent and extracting frequency as factors.The influences of factors to different degree with an order of ethanol concentration，extracting frequency，the ratio of raw materials to solvent，extracting time. The optimal extraction technology was as follow:the concentration of ethanol was 60%，the extracting time was 20min，the ratio of raw materials to solvent was 1∶40 and extracting frequency was 1 time.The extraction technology was steady for the extraction of total flavonoids from Leaves of Santalum album L.，and the content of otal flavonoids from Leaves of Santalum album L.was 3.24%

leaves of Santalum album L.;total flavonoids;orthogonal experiment;extraction technology

TS201.2

B

1002－0306(2012)08－0284－03

名貴中藥檀香為檀香科植物檀香 Santalum album L.的樹干心材，具有理氣溫中、開胃止痛之功效［1］。檀香原產(chǎn)印度、印尼、馬來西亞等地，作為一種集藥用、香料、工藝雕刻材料于一身的經(jīng)濟植物，被譽為綠色的金子［2］。檀香藥材一般需30年左右才能供藥用［1］。因此，對該藥用樹種進行綜合利用研究，以提高其短期經(jīng)濟效益，已成為檀香生產(chǎn)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前，檀香葉已經(jīng)被加以綜合開發(fā)利用，并已開發(fā)成茶葉等保健食品。前期研究表明，檀香葉含有較豐富的黃酮類成分［3］，但未見關(guān)于檀香葉中總黃酮提取工藝的研究，因此，本研究通過優(yōu)化檀香葉總黃酮的提取工藝，為其質(zhì)量控制及總黃酮的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

2011－07－25 *通訊聯(lián)系人

余文新(1976－)，男，主管中藥師，研究方向:常用中藥的有效成分。

高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(20094425110009);國家工信部中藥材扶持項目(2009060)。