龐宗文，郭法謀，徐 勇，梁靜娟，彭 幸，陸 薇

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005）

高產(chǎn)木聚糖酶嗜熱子囊菌固體發(fā)酵條件與酶學性質

龐宗文，郭法謀，徐 勇，梁靜娟，彭 幸，陸 薇

（廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005）

以本實驗室從土壤中分離篩選到的一株高產(chǎn)木聚糖酶的嗜熱子囊菌QS7-2-4為生產(chǎn)菌種，進行固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵條件研究，結果表明最佳產(chǎn)酶條件為：玉米芯∶麩皮為7∶3（w/w）；最佳氮源為酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量為1.5%；吐溫-80添加量為0.5%，初始pH為7.2，培養(yǎng)基含水量為80%，250mL三角瓶裝料量為8g，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間72h，該條件下木聚糖酶產(chǎn)量達27952U/g干基。該酶最適反應溫度為75℃，最適反應pH為4.5，在70℃以下具有良好的穩(wěn)定性，在室溫下儲藏150d仍然保留87%的活性。

木聚糖酶，固體發(fā)酵，嗜熱子囊菌

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）QS7-2-4從廣西各地采集的土樣中分離篩選并鑒定，保藏在本實驗室；玉米芯、甘蔗渣、玉米秸稈、稻草 取自農(nóng)田，經(jīng)干燥粉碎后過40目篩備用；麩皮 購自農(nóng)貿(mào)市場；樺木木聚糖和木糖 Sigma公司，純度大于99%；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純；PDA平板培養(yǎng)基 去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，pH自然；固體發(fā)酵培養(yǎng)基 稱取8g碳源于250mL三角瓶中，加入32mL營養(yǎng)鹽溶液，pH自然，121℃滅菌30min；營養(yǎng)鹽溶液（g/L） K2HPO42.4，（NH4）2SO41.5，KH2PO41.0，CaCl20.3，MgSO40.3，尿素0.7，酵母浸膏4.8，吐溫-80 1.7，微量元素液1.0mL，蒸餾水充分溶解，現(xiàn)配現(xiàn)用；微量元素液（g/L） ZnSO41.4，MnSO41.6，CoCl22.0，F(xiàn)eSO42.5，用蒸餾水充分溶解。

1.2 實驗方法

1.2.1 固體發(fā)酵和粗酶液的制備 將保藏的菌種接種到PDA平板上，50℃培養(yǎng)96h進行活化。挑取3環(huán)菌絲接種到固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后置50℃培養(yǎng)96h。稱取濕曲5g于干燥三角瓶中，加入150mL的0.05mol/L pH4.8的檸檬酸緩沖溶液，置180r/min的搖床上室溫浸提2h，4℃冷凍離心（12000r/min，10min），上清液即為木聚糖酶粗酶液。同時稱取濕曲5g放入干燥培養(yǎng)皿中，放入100℃烘箱中烘干至恒重。

1.2.2 固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 在250mL三角瓶中分別考察不同的碳源、氮源、裝料量、含水量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、吐溫-80添加量等因素對產(chǎn)酶的影響。

1.2.3 木聚糖酶的酶學性質初探 分別考察粗酶液中木聚糖酶的最佳反應溫度、最佳反應pH以及溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性。

1.2.4 木聚糖酶活力的測定 酶活測定采用DNS法：將0.1mL適當稀釋的粗酶液加入到15mL的具塞試管中，加入1%（w/v）用pH4.8的檸檬酸緩沖溶液配制的樺木木聚糖溶液0.9mL，70℃反應10min。冰浴迅速冷卻，加入1.5mL DNS試劑，充分混勻后置沸水浴中煮沸5min，迅速用冷水冷卻至室溫，于540nm下測定產(chǎn)生的還原糖量，用滅活酶液作空白對照。酶活力定義：在70℃、pH4.8條件下，每分鐘生成1μmol木糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

圖1 不同單一碳源對菌株QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of carbon source on xylanase production of QS7-2-4

2.1.1 不同碳源對產(chǎn)木聚糖酶的影響 采用麩皮、玉米芯、玉米桿、稻草秸稈、花生殼、木薯渣、木薯桿渣為單一碳源進行固體發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，結果如圖1所示。圖1結果表明，以麩皮、玉米芯為碳源時木聚糖酶產(chǎn)量較高，分別達到12956U/g干基和9876U/g干基。以麩皮、玉米芯為主要原料進行復合碳源實驗，結果如圖2所示。由圖2可知當玉米芯∶麩皮為7∶3時木聚糖酶活力最高，達到16437U/g干基，比單一碳源有較大幅度提高，以下所作發(fā)酵條件均以玉米芯∶麩皮（7∶3）作為碳源。

圖2 玉米芯與麩皮的不同比例對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of different ratio of corncob to wheat bran on xylanase production of QS7-2-4

2.1.2 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響 以玉米芯∶麩皮（7∶3）作為碳源，去除營養(yǎng)鹽溶液中的氮源，分別添加不同的氮源，考察不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，氮源的添加量以碳源量為基準計算。實驗結果如表1所示。表1實驗結果表明有機氮源普遍好于無機氮源，在無機氮源中以添加1.0%（NH4）2SO4的培養(yǎng)基產(chǎn)酶水平最高，達到17020.51U/g干基，在有機氮源中以酵母浸膏和胰蛋白胨混合氮源時產(chǎn)酶活性最高，達到23169.23U/g干基。另外，在選用廉價的農(nóng)副產(chǎn)品花生麩和豆粕作為氮源時也取得了良好的效果，添加5%花生麩木聚糖酶活力達到18844.87U/g干基，添加8%豆粕木聚糖酶活力可達到19120.88U/g干基，這一實驗結果將為工業(yè)化生產(chǎn)提供重要的參考。

表1 不同氮源對發(fā)酵QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Table 1 Effect of nitrogen sources on fermentation of QS7-2-4 xylanase production

2.1.3 三角瓶裝料量對產(chǎn)木聚糖酶的影響 裝料量對木聚糖酶產(chǎn)量的影響如圖3所示，在較少的裝料量情況下，水分散失較快，菌體生長受到影響，木聚糖酶產(chǎn)量較低。在較多的裝料量的情況下，固體曲內部散熱及氧傳遞困難，故木聚糖酶產(chǎn)量也較低。實驗表明，在250mL三角瓶中，最佳裝料量為8g，此時木聚糖酶產(chǎn)量可達22161U/g干基。

圖3 培養(yǎng)基裝料量對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of the amount of medium in 250mL flask on xylanase production of QS7-2-4

2.1.4 發(fā)酵溫度對產(chǎn)木聚糖酶的影響 將固體發(fā)酵培養(yǎng)基分別在35、40、45、50、55、60℃下培養(yǎng)4d，考察發(fā)酵溫度對產(chǎn)木聚糖酶的影響，結果如圖4所示。QS7-2-4在50℃下發(fā)酵其產(chǎn)木聚糖酶能力最強，發(fā)酵4d木聚糖酶活力可達24233U/g干基。菌體在35、40、45℃發(fā)酵時生長緩慢，當發(fā)酵至84h時，菌體才剛長滿培養(yǎng)基。而在55℃發(fā)酵時，菌體能較快生長，但過早衰老，且培養(yǎng)基的水分散失較快，不利于產(chǎn)酶。在60℃培養(yǎng)時，只有少量菌體生長且很快衰老，水分散失很快。QS7-2-4的最佳發(fā)酵溫度為50℃。

圖4 發(fā)酵溫度對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of temperature on xylanase production of QS7-2-4

圖5 培養(yǎng)基初始pH對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.5 Effect of initial medium pH on xylanase production of QS7-2-4

2.1.5 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)木聚糖酶的影響 將營養(yǎng)鹽溶液調至不同的pH，并以此pH不同的營養(yǎng)鹽溶液配制固體發(fā)酵培養(yǎng)基。接種后在50℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d，測定木聚糖酶活力，結果如圖5所示。從圖5可以看出初始pH對木聚糖酶的產(chǎn)量影響不顯著，因初始營養(yǎng)鹽溶液的pH為7.2，因此QS7-2-4發(fā)酵木聚糖酶的pH為7.2。

2.1.6 發(fā)酵時間對產(chǎn)木聚糖酶的影響 固體發(fā)酵于50℃下進行，每隔6h取樣測定酶活，QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的時間過程如圖6所示。當發(fā)酵至48h時，發(fā)酵基質中長滿菌體，木聚糖酶活力也迅速升高。之后菌體量不再明顯增加，主要為產(chǎn)酶階段，當發(fā)酵至72h時，酶活力達到22948U/g干基，之后酶活力基本穩(wěn)定。因此QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的最適時間為72h，這是目前國內耐熱木聚糖酶發(fā)酵時間最短的菌株，其他報道的菌株大部分需要5~7d或需要更長時間。

圖6 發(fā)酵時間對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.6 Effect of fermentation time on xylanase production of QS7-2-4

2.1.7 吐溫-80添加量對產(chǎn)木聚糖酶的影響 在固體培養(yǎng)基中分別添加不同量的吐溫-80，置50℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72h，測定木聚糖酶活力，結果如圖7所示。吐溫-80是一種表面活性劑，可促進細胞產(chǎn)生的木聚糖酶釋放至細胞外，降低木聚糖酶的阻遏作用，提高木聚糖酶產(chǎn)量。當吐溫-80的添加量從0.1%增至0.5%時，木聚糖酶產(chǎn)量隨之提高；添加量為0.5%～1.1%時酶產(chǎn)量穩(wěn)定；但過高含量的吐溫-80又對細胞產(chǎn)生毒害作用，當吐溫-80添加量大于1.1%時，木聚糖酶產(chǎn)量降低。從酶活力與經(jīng)濟角度考慮，吐溫-80最適添加量為0.5%。

圖7 吐溫-80添加量對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.7 Effect of Tween-80 content on xylanase production of QS7-2-4

2.1.8 固體曲含水量對產(chǎn)木聚糖酶的影響 固體曲含水量對產(chǎn)酶的影響如圖8所示。含水量對固體曲發(fā)酵產(chǎn)酶影響顯著，含水量過高或過低都不利于營養(yǎng)物的利用、菌體的生長及酶的產(chǎn)生。含水量過低時，菌體生長緩慢且水分蒸發(fā)較快，使菌體因缺水而造成代謝緩慢甚至停止，造成產(chǎn)酶量較低。含水量過高時則會引起培養(yǎng)基粘結，使氧傳遞困難、培養(yǎng)基內部溶氧不足，使菌體生長繁殖緩慢，而且容易造成燒曲，從而影響酶產(chǎn)量。因此需要使培養(yǎng)基的含水量適度，從圖8可以看出最佳含水量為80%，此時菌體產(chǎn)酶達到最大值27952U/g干基。

圖8 固體曲含水量對QS7-2-4產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.8 Effect of water content in solid medium on xylanase production of QS7-2-4

2.2 QS7-2-4木聚糖酶酶學性質

2.2.1 木聚糖酶的最適反應溫度 分別在不同的反應溫度下測定粗酶液中的木聚糖酶活力，結果如圖9所示。當反應溫度從40℃上升到75℃時，木聚糖酶活力隨溫度升高顯著增強，75℃時酶活力達到最大值24032U/g干基，且酶活在70～80℃之間差異不大。當反應溫度超過80℃時，酶活力迅速下降。因此QS7-2-4木聚糖酶的最適反應溫度為70～80℃。

圖9 溫度對QS7-2-4木聚糖酶活力的影響Fig.9 Effect of temperature on xylanase activity of QS7-2-4

2.2.2 木聚糖酶的最適反應pH 分別在不同pH的緩沖液下測定粗酶液中的木聚糖酶活力，結果如圖10所示。從圖10可知，pH對QS7-2-4木聚糖酶的酶活力影響比較顯著，最適pH范圍也比較窄，為4.5，當pH大于6.5或低于4.0時，酶活力迅速降低。在pH為4.5~ 5.5范圍內，該木聚糖酶有較高的酶活力。

圖10 pH對QS7-2-4木聚糖酶活性的影響Fig.10 Effect of pH on xylanase activity of QS7-2-4

2.2.3 木聚糖酶的熱穩(wěn)定性 在pH4.8的檸檬酸鈉緩沖液中，將酶液分別在30、40、50、60、70、80℃恒溫水浴鍋中保溫1h，然后在70℃下測定其木聚糖酶活，結果如圖11所示。從圖11可知，在40～60℃條件下保溫1h木聚糖酶的酶活力基本不變，在70℃條件下保溫1h木聚糖酶的殘余酶活力為88.41%，而在80℃下保溫酶活力迅速降低，保溫1h后殘余酶活力只有5.84%。說明該木聚糖酶在70℃以下穩(wěn)定，溫度高于70℃將破壞該酶蛋白的空間結構，使該酶失去活性。

圖11 溫度對QS7-2-4木聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of temperature on xylanase stability of QS7-2-4

2.2.4 木聚糖酶的pH穩(wěn)定性 分別將木聚糖酶的粗酶液調至不同的pH，室溫放置60min，然后在pH4.8、70℃條件下測定殘余的木聚糖酶活力。以原始粗酶液（pH4.8）的酶活力為100%，計算相對酶活，結果如圖12所示。從圖中可以看出，該木聚糖酶在pH4.5～5.5之間比較穩(wěn)定，放置60min后殘余的木聚糖酶活力都在95%以上，pH低于4.0或高于6.0均導致該木聚糖酶的快速失活。

圖12 pH對QS7-2-4木聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of pH on xylanase stability of QS7-2-4

2.2.5 木聚糖酶的儲藏穩(wěn)定性 在木聚糖酶的粗酶液（pH4.8）中加入適量的防腐劑，分別在室溫和4℃冰箱中放置，定期取樣測定木聚糖酶的酶活，結果如圖13所示。從圖中可以看出，該木聚糖酶具有良好的儲藏穩(wěn)定性，在室溫下放置150d還能保持87%的活性。

圖13 儲藏時間對QS7-2-4木聚糖酶穩(wěn)定性的影響Fig.13 Effect of stored time on xylanase stability of QS7-2-4

3 結論與討論

本研究從自然界土壤樣品中篩選到一株高產(chǎn)木聚糖酶的嗜熱子囊菌（Thermoascus aurantiacus）QS7-2-4，其固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的最佳條件為：玉米芯∶麩皮為7∶3（w/w）；最佳氮源為酵母膏和胰蛋白胨的混合氮源，添加量為1.5%；吐溫-80添加量為0.5%，初始pH為7.2，培養(yǎng)基含水量為80%，250mL三角瓶裝料量為8g，發(fā)酵溫度50℃，發(fā)酵時間72h，該條件下木聚糖酶產(chǎn)量達27952U/g干基。該酶的最適反應溫度為75℃，最適反應pH為4.5，在70℃以下具有良好的穩(wěn)定性，在室溫下儲藏150d仍然保留87%的活性。

木聚糖酶在飼料加工、造紙漂白、面包改良及啤酒和果汁的澄清中有廣泛的應用，目前市場上的木聚糖酶絕大多數(shù)是中低溫木聚糖酶，其最適酶反應溫度為50℃，熱穩(wěn)定性較差，通常超過60℃活性基本喪失，難以滿足某些工業(yè)應用過程要求。如在啤酒制造過程中，木聚糖酶通常在大麥液化和糖化工段加入，此時的料溫一般為70～80℃左右，傳統(tǒng)的中低溫木聚糖酶在此溫度下很快就失去其活性，不適合用于啤酒行業(yè)。而本研究所獲得的木聚糖酶的最適反應溫度為75℃，具有良好的溫度穩(wěn)定性，非常適合于啤酒生產(chǎn)過程的澄清工藝，是一種很有工業(yè)化生產(chǎn)應用前景的木聚糖酶。

[1]江正強，李里特，李穎.耐熱木聚糖酶研究進展[J].中國生物工程雜志，2003，23（8）：47-51.

[2]Brienzo M，Arantes V，Milagres AMF.Enzymology of the thermophilic ascomycetous fungus Thermoascus aurantiacus[J]. Fungal Biol Rev，2008，22：120-130.

[3]謝響明，何曉青.微生物的木聚糖酶及其生物漂白研究進展[J].北京林業(yè)大學學報，2003，25（3）：111-116.

[4]李里特，李秀婷，江正強，等.嗜熱真菌耐熱木聚糖酶對面包品質的改善[J].中國糧油學報，2004，19（5）：11-15.

[5]鄭翔鵬，王國川，林海峰，等.木聚糖酶在啤酒中的應用研究[J].啤酒科技，2008（9）：27-36.

[6]鐘茂，謝和芳.飼料木聚糖酶的開發(fā)[J].飼料工業(yè)，2005，26（14）：56-59.

[7]Knob A，Terrasan CRF，Carmona EC.β-Xylosidases from filamentous fungi：an overview[J].World J Microbiol Biotechnol，2010，26：389-407.

[8]Polizeli MLTM，Rizzatti ACS，Monti R，et al.Xylanases from fungi：properties and industrial applications[J].Appl Microbiol Biotechnol，2005，67：577-591.

[9]李秀婷，楊紹青，江正強，等.利用農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)嗜熱真菌（T.lanuginosus）耐熱木聚糖酶的固體發(fā)酵研究[J].工業(yè)微生物，2004，34（4）：13-18.

[10]楊紹青，閆巧娟，江正強，等.嗜熱擬青霉固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶條件的優(yōu)化[J].微生物學通報，2006，33（3）：1-6.

[11]Sonia KG，Chadha BS，Saini HS.Sorghum straw for xylanase hyper-production by Thermomyces lanuginosus（D2W3）under solid-statefermentation[J].BioresourTechnol，2005，96：1561-1569.

[12]Badhan AK，Chadha BS，Sonia KG，et al.Functionally diverse multiple xylanases of thermophilic fungus Myceliophthora sp. IMI 387099[J].Enzyme Microb Technol，2004，35：460-466.

Optimization of xylanase production conditions by Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 in solid state fermentation and the properties of xylanase

PANG Zong-wen，GUO Fa-mou，XU Yong，LIANG Jing-juan，PENG Xing，LU Wei
（College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China）

The conditions in solid fermentation of a strain of Thermoascus aurantiacus QS7-2-4 with high yield of xylanase were studied.The research results indicated that the optimum fermentation conditions were：corncob：wheat bran was 7∶3（w/w），the initial pH was 7.2，the water content of medium was 80%，the feeding amount in 250mL flask was 8g，fermentation temperature was 50℃，fermentation time was 72h，the amount of Tween-80 was 0.5%，the best nitrogen source was 1.5%of peptone.The activity of xylanase under the optimum fermentation condition reached 27952U/g.The optimum temperature and pH of this xylanase were 75℃ and 4.5，respectively.The xylanase was stable when the temperature was below 70℃.The activity of xylanase remained 87%after stored for 150d at room temperature.

xylanase；solid state fermentation；Thermoascus aurantiacus

TS201.3

A

1002-0306（2012）03-0170-05

木聚糖是植物半纖維素的主要組分，在自然界中含量僅次于纖維素，主鏈由木糖殘基以β-1，4糖苷鍵連接而成，木聚糖的降解對于植物資源的利用具有重要的意義。水解木聚糖的酶主要是內切β-1，4木聚糖酶和β-木糖苷酶，β-1，4木聚糖酶是一類以內切方式水解木聚糖分子中β-1，4-木糖苷鍵的酶類，水解產(chǎn)物主要為不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最關鍵的酶[1-2]。近年來，木聚糖酶在飼料、造紙、食品加工及燃料乙醇生產(chǎn)等行業(yè)都有廣泛的應用。如在制漿造紙工業(yè)中用于紙漿的生物漂白，在食品工業(yè)中用于功能性低聚木糖制造、面團改良劑以及改善啤酒工業(yè)的麥汁和啤酒的過濾澄清等，在飼料工業(yè)中作為飼料添加劑可有效分解飼料中的抗營養(yǎng)因子[2-8]。由于木聚糖酶在許多工業(yè)應用過程中常需要在高溫下進行操作，因此對耐熱木聚糖酶的研究開發(fā)已引起了國內外學者的高度重視，在以嗜熱真菌生產(chǎn)耐熱木聚糖酶的研究與開發(fā)方面已經(jīng)取得了一些有工業(yè)化生產(chǎn)價值的研究成果[9-12]。本實驗室從土壤中分離篩選到的一株高產(chǎn)木聚糖酶的嗜熱子囊菌Thermoascus aurantiacus QS7-2-4，本文主要研究該菌固體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵工藝條件，并對其產(chǎn)生的木聚糖酶的酶學性質進行了初步的研究，為耐熱木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應用提供科學依據(jù)。

2011－05－09

龐宗文（1984-），男，博士，副教授，研究方向：微生物酶學及生物質能源。